ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造
Summary
ここでは、CRISPR Cas技術を用いてCAR-T細胞を改変する原発ヒトT細胞における遺伝子編集プロトコルを紹介する。
Abstract
キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T細胞)を用いた養子細胞療法は、血球悪性腫瘍患者において顕著な臨床的有効性を示し、現在、様々な固形腫瘍について調査されている。CAR-T細胞は、患者の血液からT細胞を除去し、それらを設計して、標的腫瘍細胞を認識して排除するためにT細胞をリダイレクトする合成免疫受容体を発現させることによって生成される。CAR-T細胞の遺伝子編集は、現在のCAR-T細胞療法の安全性を向上させ、CAR-T細胞の有効性をさらに高める可能性を秘めています。ここでは、ヒトCRISPRが設計したCD19指向CAR-T細胞の活性化、拡張、および特性評価の方法について説明する。これはCARレンチウイルスベクターの導入とT細胞の目的の遺伝子を標的にするシングルガイドRNA(sgRNA)およびCas9エンドヌクレアーゼの使用を含む。このプロトコルで説明されている方法は、この研究に使用されるものを超えて、他のCAR構築物および標的遺伝子に普遍的に適用することができる。さらに、このプロトコルは、臨床グレードのヒトT細胞の高効率、多重CRISPR-Cas9エンジニアリングを再現的に達成するために、gRNA設計、鉛gRNA選択および標的遺伝子ノックアウト検証のための戦略を議論する。
Introduction
キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞療法は、養子細胞療法および癌免疫療法の分野に革命をもたらしています。CAR-T細胞は、T細胞活性化および共刺激に必要かつ十分なTCRzeta鎖および共刺激ドメインに由来するシグナル伝達ドメインと抗原特異的単鎖抗体断片を結合した合成免疫受容体を発現するT細胞を設計する1、2、3、4.CAR-T細胞の製造は、患者自身のT細胞を抽出し、続いてCARモジュールのex vivoウイルス伝達と、人工抗原提示細胞として機能する磁気ビーズを有するCAR-T細胞産物の拡張を行う。拡張されたCAR-T細胞は、それらが生着し、標的腫瘍細胞を排除し、さらに注入後6、7、8の複数年間持続することができる患者に再注入される。CAR-T細胞療法はB細胞悪性腫瘍において顕著な応答率をもたらしたが、固形腫瘍の臨床的成功は、T細胞浸潤不良9、免疫抑制性腫瘍微小環境10、抗原被覆および特異性、CAR-T細胞機能障害11、12を含む複数の要因によって挑戦されてきた。.現在のCAR-T細胞療法のもう一つの制限は、自家T細胞の使用を含む。化学療法と高腫瘍負担の複数のラウンドの後、CAR-T細胞は、自家CAR-T細胞の製造に関連する時間と費用に加えて、健康なドナーからの同種CAR-T製品と比較して質が悪い場合があります。CRISPR/Cas9によるCAR-T細胞産物の遺伝子編集は、CAR-T細胞13、14、15、16、17の現在の限界を克服するための新しい戦略を表す。
CRISPR/Cas9は哺乳動物細胞18,19における標的ゲノム編集に使用できる2つの構成要素システムである。CRISPRに関連するエンドヌクレアーゼCas9は、標的DNA配列20との塩基対を介して小さなRNAによって導かれる部位特異的な二本鎖破断を誘発し得る。修復テンプレートがない場合、二本鎖破断は、誤差が起こりやすい非相同端結合(NHEJ)経路によって修復され、挿入および欠失突然変異(INDELs)19、20、21を介してフレームシフト突然変異または早期停止コドンをもたらす。効率、使いやすさ、費用対効果、多重ゲノム編集能力により、CRISPR/Cas9は自家細胞や異系CAR-T細胞の有効性と安全性を高める強力なツールです。この方法は、CAR コンストラクトを TCR に置き換えることで、TCR 方向 T セルを編集する場合にも使用できます。さらに、移植片対宿主病を引き起こす可能性が限られている同種CAR-T細胞は、TCR、b2m、およびHLA遺伝子座を編集することによっても生成され得る。
このプロトコルでは、T細胞のCRISPRエンジニアリングとCARトランスジーンのウイルスベクター媒介送物を組み合わせて、有効性と安全性を高めるゲノム編集CAR-T細胞製品を生成する方法を示す。図 1に、プロセス全体のスケマティック ダイアグラムを示します。この手法を用いて、ヒトCAR-T細胞の高効率遺伝子ノックアウトを実証しました。 図2A は、T細胞を編集および製造するための各ステップのタイムラインを詳細に説明する。このアプローチをさまざまな標的遺伝子に適用するために、ガイドRNA設計およびノックアウト検証のための戦略も議論されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、CRISPR Cas9技術を用いた遺伝子編集CAR-T細胞のアプローチを説明し、機能と有効性を更にテストする製品を製造する。上記のプロトコルは、キメラ抗原受容体を有する工学的T細胞と組み合わせた一次ヒトT細胞においてCRIPSR遺伝子編集を行う上で最適化されている。このプロトコルは最低のドナーへのドナーへの変動の高いノックアウト効率を可能にする。CRISPRを用いた修飾は、T細胞…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、正常ドナーT細胞及びペンシルベニア大学におけるフローサイトメトリーコアを提供するためのヒト免疫学コアを認める。
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
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