Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.
Abstract
Приемная клеточная терапия с использованием Т-клеток рецептора химерного антигена (CAR-T-клетки) продемонстрировала замечательную клиническую эффективность у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время исследуется на предмет различных солидных опухолей. CAR-T-клетки генерируются путем удаления Т-клеток из крови пациента и их разработки для экспрессии синтетического иммунного рецептора, который перенаправляет Т-клетки для распознавания и устранения опухолевых клеток-мишеней. Редактирование генов CAR-T-клеток имеет потенциал для повышения безопасности современных CAR-T-клеточных терапий и дальнейшего повышения эффективности CAR-T-клеток. Здесь мы описываем методы активации, расширения и характеристики CD19-направленных CAR-T-клеток человека, спроектированных CRISPR. Это включает в себя трансдукцию лентивирусного вектора CAR и использование однонаправленной РНК (sgRNA) и эндонуклеазы Cas9 для нацеливания генов, представляющих интерес в Т-клетках. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть универсально применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням, помимо тех, которые используются для этого исследования. Кроме того, в этом протоколе обсуждаются стратегии проектирования гРНК, отбора свинцовой гРНК и валидации нокаута генов-мишеней для воспроизводимого достижения высокоэффективной мультиплексной инженерии CRISPR-Cas9 Т-клеток человека клинического класса.
Introduction
Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR)-Т-клетками произвела революцию в области приемной клеточной терапии и иммунотерапии рака. CAR-T-клетки представляют собой инженерные Т-клетки, экспрессирующие синтетический иммунный рецептор, который сочетает антиген-специфический фрагмент одноцепочечного антитела с сигнальными доменами, полученными из цепи TCRzeta, и костимуляторными доменами, необходимыми и достаточными для активации Т-клеток и костимуляции1,2,3,4 . Производство CAR-T-клеток начинается с извлечения собственных Т-клеток пациента, за которыми следует вирусная трансдукция ex vivo модуля CAR и расширение продукта CAR-T-клеток магнитными шариками, которые функционируют как искусственные антиген-презентационные клетки5. Расширенные CAR-T-клетки повторно вводятся пациенту, где они могут приживляться, устранять опухолевые клетки-мишени и даже сохраняться в течение нескольких лет после инфузии6,7,8. Хотя терапия CAR-T-клетками привела к замечательным показателям ответа при злокачественных новообразованиях В-клеток, клинический успех солидных опухолей был поставлен под сомнение несколькими факторами, включая плохую инфильтрацию Т-клеток9,иммуносупрессивную микроокружение опухоли10,охват и специфичность антигена и дисфункцию CAR-T-клеток11,12 . Другое ограничение современной терапии CAR-T-клетками включает использование аутологицных Т-клеток. После нескольких раундов химиотерапии и высокой опухолевой нагрузки CAR-T-клетки могут быть низкого качества по сравнению с аллогенными продуктами CAR-T от здоровых доноров в дополнение ко времени и затратам, связанным с производством аутологичных CAR-T-клеток. Генное редактирование продукта CAR-T-клеток с помощью CRISPR/Cas9 представляет собой новую стратегию преодоления существующих ограничений CAR-T-клеток13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 представляет собой двухкомпонентную систему, которая может быть использована для целенаправленного редактирования генома в клетках млекопитающих18,19. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы, управляемые небольшими РНК, путем спаривания оснований с целевой последовательностью ДНК20. При отсутствии шаблона восстановления двухцепочечные разрывы восстанавливаются по подверженному ошибкам пути негомологичных конечных соединений (NHEJ), что приводит к мутациям сдвига кадра или преждевременным стоп-кодонам через мутации вставки и делеции (INDL)19,20,21. Эффективность, простота использования, экономичность и возможность мультиплексного редактирования генома делают CRISPR/Cas9 мощным инструментом для повышения эффективности и безопасности аутологичных и аллогенных CAR-T-клеток. Этот подход также может быть использован для редактирования TCR-направленных Т-клеток путем замены конструкции CAR на TCR. Кроме того, аллогенные CAR-T-клетки, которые имеют ограниченный потенциал вызывать болезнь трансплантата по сравнению с болезнью хозяина, также могут быть сгенерированы путем редактирования генов локуса TCR, b2m и HLA.
В этом протоколе мы показываем, как CRISPR-инженерия Т-клеток может быть объединена с вирусной векторной доставкой CAR-Transgene для генерации отредактированных геномом продуктов CAR-T-клеток с повышенной эффективностью и безопасностью. Принципиальная схема всего процесса показана на рисунке 1. Используя этот подход, мы продемонстрировали высокоэффективный нокаут гена в первичных клетках CAR-T человека. На рисунке 2A подробно описана временная шкала каждого этапа редактирования и изготовления Т-клеток. Также обсуждаются стратегии проектирования направляющей РНК и нокаутной валидации для применения этого подхода к различным генам-мишеням.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем подходы к редактированию генов CAR-T-клеток с использованием технологии CRISPR Cas9 и производству продуктов для дальнейшего тестирования функции и эффективности. Вышеуказанный протокол был оптимизирован для выполнения редактирования генов CRIPSR в первичных Т-клетках чело…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем ядро иммунологии человека для обеспечения нормальных донорских Т-клеток и ядро проточной цитометрии в Университете Пенсильвании.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Ricerca sul cancro. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
