Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera DNA-fingeravtrycksprofiler genom att förstärka VNTR locus D1S80 från epitelcells-DNA.
Inom biologiska vetenskaper har DNA-fingeravtryck använts i stor utsträckning för faderskapstestning, rättsmedicinska tillämpningar och fylogenetiska studier. Här beskriver vi en tillförlitlig och robust metod för genotypning av individer genom variabelt antal Tandem Repeat (VNTR) analys i samband med grundutbildningslaboratoriet klasser. Den mänskliga D1S80 VNTR locus används i detta protokoll som en mycket polymorf markör baserat på variation i antalet repetitiva sekvenser.
Detta enkla protokoll förmedlar användbar information för lärare och implementering av DNA-fingeravtryck i praktiska laboratorieklasser. I den presenterade laboratorieövningen används DNA-extraktion följt av PCR-förstärkning för att bestämma genetisk variation vid D1S80 VNTR-locus. Skillnader i fragmentstorleken på PCR-produkter visualiseras av agarose gel elektrofores. Fragmentstorlekarna och upprepningsnumren beräknas baserat på en linjär regression av storleken och migrationsavståndet för en DNA-storleksstandard.
Enligt den här guiden bör eleverna kunna:
• Skörda och extrahera DNA från buccal slemhinnor epitelceller
• Utför ett PCR-experiment och förstå funktionen hos olika reaktionskomponenter
• Analysera ampliconerna med agarose gelelektrofores och tolka resultaten
• Förstå användningen av VNTR i DNA-fingeravtryck och dess tillämpning inom biologiska vetenskaper
Molekylär fingeravtryck, även kallad DNA-fingeravtryck, introducerades av Sir Alec Jeffreys när han arbetade vid institutionen för genetik vid University of Leicester 19841. Det är baserat på de 0,1% av det mänskliga genomet som skiljer sig mellan individer och består av cirka tre miljoner varianter. Dessa unika skillnader i genotypen möjliggör differentiering mellan individer och kan därför fungera som ett genetiskt fingeravtryck förutom monozygota tvillingar. Följaktligen används DNA-fingeravtryck för uppskattning av släktskap hos olika individer som tillämpas till exempel i faderskapstestning eller i studier av befolkningsmångfald. I våra laboratorieklasser strävade vi efter att förmedla begreppet DNA-fingeravtryck och allelfrekvenser. Metoden som beskrivs här visar en tillförlitlig och robust metod för genetisk fingeravtryck genom att analysera variabelt antal tandemrepetitioner (VNTR) vid D1S80-locus. Metoden omfattar extraktion av DNA från buccal slemhinnor epitelceller och efterföljande Polymerase Chain Reaction (PCR) för att förstärka D1S80 locus, följt av visualisering av fragment längd skillnader på en agarose gel.
D1S80 VNTR minisatellite locus är mycket varierande och ligger i den telomeriska regionen kromosom 1 (1 p36-p35). Det identifierades och beskrevs av Karsai och medarbetare 1990 som en locus med en kärnrepetitionsenhet på 16 bp, vilket möjliggör separation av alleler som skiljer sig med bara en enhet2. Dessutom visar D1S80 en hög grad av variation med en mutationshastighet på cirka 7,77 x 10-53. D1S80 har en hög grad av heterozygositet4,5 (t.ex. 80,8% heterozygositet för kaukasier6 och upp till 87% heterozygositet för afroamerikaner7). Dessutom är D1S80-locus polymorf i de flesta populationer, med vanligtvis över 15 olika alleler som bär 14 till 41 repetitioner vardera. Frekvensen av D1S80-alleler varierar mellan populationerna. Allelen med 24 upprepade enheter (allel 24) är vanligast i europeiska och asiatiska populationer, medan allel 21 är vanligast i afrikanskapopulationer 4,7,8,9,10. Följaktligen är fördelningen av allelfrekvensen diagnostisk för olika befolkningsgrupper och måste beaktas vid uppskattningen av släktskap (t.ex. i faderskapstester).
PCR-baserad förstärkning av D1S80 VNTR locus har varit en mycket användbar metod inom kriminalteknik, faderskapstester, sjukdomsanalys och befolkningsmångfaldsstudier11,12,13,14. Medan i kriminalteknik idag användningen av VNTR har ersatts av korta tandemrepetitioner, används D1S80 VNTR-johannesbröd i stor utsträckning vid bestämning av ursprung och genetiska relationer mellan och mellanpopulationerna 4,8,9,11. Dessutom används det ofta för att lära DNA-fingeravtryck i praktiskalaboratorieklasser 15,16. Metoden som beskrivs här representerar en robust, kostnadseffektiv och lättanvänd metod med en mycket hög framgångsgrad i grundutbildningslaboratoriet. Syftet med denna artikel är att ge en översikt över arbetsflödet för molekylär analys av den mänskliga D1S80 minisatellite locus från buccal slemhinnan epitelceller. Det inkluderar demonstration av tekniker, förenklade protokoll och praktiska förslag som beskrivs i tidigare publicerade verk2,17.
Här beskrev vi en enkel och kostnadseffektiv metod för att implementera molekylär fingeravtryck i grundutbildningskurser.
För att screena för genetisk variation vid D1S80-locus krävs mänsklig biologisk provsamling tillsammans med DNA-extraktion och analys. Det är viktigt att den etiska användningen av mänskliga biologiska exemplar säkerställs under hela processen. Provhanteringen kontrolleras inom ett omfattande regelverk som säkerställer korrekt användning av prover och tillhörande data18 (t.ex. samtycke till användning av humanbiologiskt material). Deltagarna måste informeras på lämpligt sätt om användningen av sina prover, risken för upptäckt av avvikelser i genetiska relationer (t.ex. för närstående personer), integritetsskydd och avsikter för framtida lagring av biologiska exemplar och data. Alla givare (studenter eller kollegor) måste ge sitt samtycke fritt och förstå rätten att dra sig tillbaka utan att ange skäl. I allmänhet är det nödvändigt att göra sig bekant med respektive riktlinjer och förordningar för hantering av mänskliga prover innan man genomför denna labbklass.
För insamling av buccal slemhinnor epitelial celler i grundlaboratorium kurser, måste försiktighet vidtas för att undvika kontaminering av DNA prover med DNA från operatören eller med DNases. Det rekommenderas att labbrockar, handskar och skyddsglasögon alltid används samt sterila svabbprover och mikrocentrifugrör. Buccal swab-baserad cellskörd anses vara en bekväm och kostnadseffektiv metod för insamling av genetiskt material som lämpar sig för PCR-baserad VNTR-analys, eftersom det är relativt billigt och icke-invasivt. Förutom buccal svabbprover är saliv den vanligaste orala provtagningsmetoden för medicinsk forskning. Det har visat sig att buccal svabbprover innehåller en högre andel epitelceller än saliv, vilket gör dem mer tillförlitliga när det gäller att tillhandahålla tillräcklig mängd och kvalitet av DNA för PCR-baserad D1S80 VNTR-analys19,20. Dessutom kan buccal svabbprover skickas ut efter självinsamling som övervinner geografiska hinder när de används, till exempel i befolkningsmångfaldsstudier21.
DNA-extraktion har blivit relativt enkelt på grund av utvecklingen av extraktionssatser från olika företag. Användningen av dessa satser kanske dock inte är lämplig i laboratorieklasser på grund av begränsade ekonomiska resurser. Här presenterade vi en enkel, snabb och kostnadseffektiv metod för DNA-extraktion från mänskliga prover utan behov av ett kommersiellt tillgängligt DNA-extraktionskit. Den beskrivna DNA-extraktionsmetoden använder inte organiska lösningsmedel, utan cellulära proteiner avlägsnas genom att saltkoncentrationen ökar med hjälp av en 8 M kaliumacetatlösning. Denna metod möjliggör också hantering av flera prover samtidigt och ger tillräckligt med DNA för flera genotypanalyser för varje prov.
PCR är en vanlig teknik i många molekylära laboratorier. Även om det i allmänhet är problemfritt finns det fallgropar som kan komplicera reaktionen som ger falska resultat, som har diskuterats någon annanstans22. PCR villkor som presenteras här har verkat mycket robust inför dålig mall DNA kvalitet, men brist på PCR amplifiering observerades ändå ibland när man använder mallar med extremt låga DNA koncentrationer på grund av att dålig buccal epitelial cell skörd. DE DNA-primers som används i denna studie kan beställas från olika företag, till exempel de som citeras i materialtabellen i slutet av detta papper. Särskild försiktighet måste vidtas vid arbete med DNA-primers för att undvika kontaminering med DNases eller DNA från operatören. PCR-produkter bör också hållas kalla när de inte används.
Ett annat kritiskt steg är agarose gel elektrofores. Fragment som skiljer sig åt med endast en upprepad enhet på 16 bp får inte separeras i gelelektroforesen och visas därför som ett enda band. I detta fall kan en korrekt bestämning av antalet upprepade enheter i de testade D1S80-allelerna inte garanteras. Därför bör gelens körtid ökas medan spänningen måste minskas och gelkoncentrationen kan ökas för att ge en bättre upplösning och separation av de enskilda banden.
Det är värt att nämna att inte alla alleler för en VNTR-locus innehåller kompletta repetitionsenheter. Icke-konsensus alleler (mikrovarianter) som innehåller ofullständiga upprepade enheter är vanliga som mest VNTR lokus och deras storlekar faller i mellan storlekar av alleler med full upprepa enheter. Dessa mikrovarianter kan knappt detekterbara med agarose gelelektrofores. Däremot kan tekniker som polyakrylamidgeler eller kapillärelektrofores lösa alleler som skiljer sig med en till några upprepade enheter eller mikrovarianter12,23,24,25,26. De senare teknikerna är dock mindre lämpliga för grundutbildningsklasser eftersom de har många nackdelar, inklusive användning av farliga föreningar, komplex förberedelse och brist på utrustning. Vid bestämning av fragmentstorlek måste särskild försiktighet vidtas vid mätning av avståndet mellan de migrerade DNA-fragmenten. Om banden är för diffusa för att mätas exakt kan beräkningen av D1S80-allelfragmentstorleken genom linjär regression vara felaktig, vilket resulterar i fel uppskattning av upprepade enhetsnummer. I så fall är en omkörning av agarose gel elektrofores efter optimering av gelförhållandena tillrådligt som tidigare beskrivits av Lorenz och medarbetare22.
Hela D1S80 VNTR analys förfarande presenteras här, från buccal epitelial cell skörd till fragment längd utvärdering, kan slutföras i en enda arbetsdag. Detta protokoll är en robust, kostnadseffektiv och lättanvänd metod som lämpar sig för grundutbildning av praktiska laboratorieklasser.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Kevin Graham för hans berättarröst och alla deltagare som donerade prover för detta arbete.
1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
Combs | BioRad | ||
dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
Gel caster | BioRad | ||
Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
Gel Doc XR+ | BioRad | ||
Geltray | BioRad | SubCell GT | |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
Microwave | Sharp | R-941STW | |
peqGreen | VWR | 732-3196 | |
Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
Primers | Sigma/Merck | ||
Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
Tabletop centrifuge | myFuge | ||
Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
Tris | VWR | 103156x | |
Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |