Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.
Abstract
Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.
Introduction
Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme1. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques en santé et en maladie, leur impact translationnel a été entravé par des coûts élevés, des considérations éthiques et des différences inter-espèces2,4. En se tournant vers les systèmes à base de cellules humaines pour étudier le muscle squelettique, les systèmes de culture cellulaire 2D sont favorables en raison de leur simplicité. Cependant, il y a une limite. Ce format échoue souvent à récapituler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire qui se produisent naturellement dans le corps5,6. Au cours des dernières années, les modèles de muscles squelettiques tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative puissante aux modèles animaux entiers et aux systèmes de culture 2D conventionnels en permettant la modélisation de processus physiologiquement et pathologiquement pertinents ex vivo7,8. En effet, une pléthore d’études ont rapporté des stratégies pour modéliser le muscle squelettique humain dans un format de culture 3D bioartificiel1. Une limite pour beaucoup de ces études est que la force active est quantifiée après le retrait des tissus musculaires des plates-formes de culture et la fixation à un transducteur de force, ce qui est destructeur et donc limité à servir de test final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. D’autres ont conçu des systèmes de culture qui permettent des méthodes non invasives de mesure de la force active, mais tous ne se prêtent pas à des applications de test de molécules à haute teneur7,8,9,10,14 , 18,22,23, 24,25,26,27,28 ,29.
Ce protocole décrit une méthode détaillée pour fabriquer des microtissus musculaires humains (hMMT) dans la plate-forme de muscle squelettique (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC); un dispositif à plaque de 96 puits qui prend en charge la production en vrac de microtissus musculaires squelettiques3D 30. La méthode de fabrication de plaques MyoTACTIC permet la génération d’une plaque de culture de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 96 puits et de toutes les caractéristiques de puits correspondantes en une seule étape de coulée, chaque puits nécessitant un nombre relativement faible de cellules pour la formation de microtissu. Les microtissus formés dans MyoTACTIC contiennent des myotubes alignés, striés et multinucléés qui sont reproductibles de puits en puits de l’appareil et, à maturation, peuvent répondre à des stimuli chimiques et électriques in situ30. Ici, la technique de fabrication d’un dispositif de plaque de culture PDMS MyoTACTIC à partir d’une réplique en polyuréthane (PU), une méthode optimisée pour mettre en œuvre des cellules progénitrices myogéniques humaines immortalisées pour fabriquer des hMMT, et l’évaluation fonctionnelle de la génération de force hMMT et des propriétés de manipulation du calcium sont décrites et discutées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinuclé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli et Sadegh Davoudi d’avoir contribué à l’invention de la plateforme de culture MyoTACTIC et d’avoir établi les méthodes de fabrication et d’analyse décrites ici. HL a reçu un financement d’un programme de formation en génie du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) en génie et en entrepreneuriat d’organes sur puce et d’une bourse d’études supérieures Wildcat de l’Université de Toronto. PMG est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en réparation endogène et a reçu le soutien de l’Institut ontarien de médecine régénérative, du Réseau de cellules souches et de Medicine by Design, un programme d’excellence en recherche Canada First. Des diagrammes schématiques ont été créés avec BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Riferimenti
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