Vurdering av funksjonelle beregninger av skjelettmuskulaturhelse i humane skjelettmuskulaturmikrofunksjoner
Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å produsere matriser av 3D humane skjelettmuskulaturmikrofunksjoner og minimalt invasive nedstrøms in situ-analyser av funksjon, inkludert kontraktil kraft og kalsiumhåndteringsanalyser.
Abstract
Tredimensjonale (3D) in vitro modeller av skjelettmuskulatur er et verdifullt fremskritt i biomedisinsk forskning, da de gir muligheten til å studere skjelettmuskulaturreformering og fungere i et skalerbart format som er mottagelig for eksperimentelle manipulasjoner. 3D muskelkultursystemer er ønskelige da de gjør det mulig for forskere å studere skjelettmuskulatur ex vivo i sammenheng med menneskelige celler. 3D in vitro modeller etterligner nøye aspekter av den innfødte vevsstrukturen til voksen skjelettmuskulatur. Imidlertid er deres universelle anvendelse begrenset av tilgjengeligheten av plattformer som er enkle å fremstille, koste og brukervennlige, og gir relativt høye mengder menneskelig skjelettmuskulaturvev. I tillegg, siden skjelettmuskulatur spiller en viktig funksjonell rolle som er svekket over tid i mange sykdomstilstander, er en eksperimentell plattform for mikrotissuestudier mest praktisk når minimalt invasive kalsium forbigående og kontraktile kraftmålinger kan utføres direkte i selve plattformen. I denne protokollen beskrives fabrikasjonen av en 96-brønns plattform kjent som ‘MyoTACTIC’, og masseproduksjon av 3D humane skjelettmuskulaturmikrotissuer (hMMTs). I tillegg rapporteres metodene for en minimal invasiv anvendelse av elektrisk stimulering som muliggjør gjentatte målinger av skjelettmuskulaturkraft og kalsiumhåndtering av hver mikrotissue over tid.
Introduction
Skjelettmuskulatur er et av de mest tallrike vevene i menneskekroppen og støtter viktige kroppsfunksjoner som bevegelse, varme homeostase og metabolisme1. Historisk har dyremodeller og todimensjonale (2D) cellekultursystemer blitt brukt til å studere biologiske prosesser og sykdomspatogenese, samt for å teste farmakologiske forbindelser i behandlingen av skjelettmuskulatursykdommer2,3. Mens dyremodeller har forbedret vår kunnskap om skjelettmuskulatur i helse og sykdom, har deres translasjonspåvirkning blitt hemmet av høye kostnader, etiske hensyn og interspecies forskjeller2,4. Ved å vende seg til menneskelige cellebaserte systemer for å studere skjelettmuskulatur, er 2D-cellekultursystemer gunstige på grunn av deres enkelhet. Det er imidlertid en begrensning. Dette formatet klarer ofte ikke å rekapitulere celle- og celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner som forekommer naturlig i kroppen5,6. I løpet av de siste årene har tredimensjonale (3D) skjelettmuskulaturmodeller dukket opp som et kraftig alternativ til hele dyremodeller og konvensjonelle 2D-kultursystemer ved å tillate modellering av fysiologisk og patologisk relevante prosesser ex vivo7,8. Faktisk har en mengde studier rapportert strategier for å modellere menneskelig skjelettmuskulatur i et bioartificial 3D-kulturformat1. En begrensning for mange av disse studiene er at aktiv kraft kvantifiseres etter fjerning av muskelvev fra kulturplattformene og vedlegg til en krafttransduser, som er destruktiv og dermed begrenset til å tjene som endepunktanalyse9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andre har designet kultursystemer som tillater ikke-invasive metoder for måling av aktiv kraft, men ikke alle er mottagelige for høykvalitets molekyltestingsapplikasjoner7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Denne protokollen beskriver en detaljert metode for å fremstille humane muskel mikrotissues (hMMTs) i skjelettmuskelen (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) plattform; en 96 brønnplateenhet som støtter bulkproduksjonen av 3D skjelettmuskulaturmikrotissuer30. MyoTACTIC plate fabrikasjonsmetoden muliggjør generering av en 96 brønn polydimetylsiloksan (PDMS) kulturplate og alle tilsvarende brønnfunksjoner i et enkelt støpetrinn, hvorved hver brønn krever et relativt lite antall celler for mikrotissuedannelse. Mikrotissues dannet i MyoTACTIC inneholder justerte, strikkede og multinukleerte myotuber som er reproduserbare fra brønn til brønn på enheten, og ved modning kan reagere på kjemiske og elektriske stimuli in situ30. Heri, teknikken for å produsere en PDMS MyoTACTIC kultur plate enhet fra en polyuretan (PU) kopi, en optimalisert metode for å implementere udødelige menneskelige myogene stamceller for å fremstille hMMTs, og den funksjonelle vurderingen av konstruert hMMT kraft generasjon og kalsium håndtering egenskaper er skissert og diskutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet beskriver metoder for å fremstille og analysere en 3D hMMT kulturmodell som kan brukes på studier av grunnleggende muskelbiologi, sykdomsmodellering eller for kandidatmolekyltesting. MyoTACTIC-plattformen er kostnadsvennlig, enkel å produsere og krever et relativt lite antall celler for å produsere skjelettmuskulaturmikrofunksjoner. hMMTer dannet i MyoTACTIC kulturplattform består av justerte, multinukleerte og strikkede myotuber, og reagerer på elektriske stimuli ved å initiere kalsiumtransient…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli og Sadegh Davoudi for å ha bidratt til oppfinnelsen av kulturplattformen MyoTACTIC og etablering av fabrikasjons- og analysemetodene som er beskrevet her. HL mottok støtte fra et NSERC-opplæringsprogram (Natural Sciences and Engineering Research Council) i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship og et stipend fra University of Toronto Wildcat. PMG er Canada Research Chair i EndogenOus Repair og fikk støtte for denne studien fra Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network, og fra Medicine by Design, et Canada First Research Excellence Program. Skjematiske diagrammer ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Riferimenti
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
