לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.
Abstract
הרעיון של טיפול בשילוב תרופות הופך להיות חשוב מאוד בעיקר עם עלייה דרסטית בהתנגדות לתרופות. לוח השחמט Quadruple, המכונה גם Q-checkerboard, שואפת למקסם את מספר השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד כדי למזער את הזמן והעבודה הדרושים כדי להשיג את אותן תוצאות עם פרוטוקולים אחרים. פרוטוקול זה מבוסס על טכניקת דילול מיקרו פשוט שבו התרופות מדוללות ומשולבים יחד בכמה צלחות 96-באר.
בסט הראשון של צלחות 96-באר, מרק מולר-הינטון מתווסף ואחריו התרופה הנדרשת הראשונה (למשל, Cefotaxime כאן) כדי לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר הצעד הראשון נעשה, קבוצה נוספת של צלחות 96-באר משמש כדי לדלל את התרופה השנייה (למשל, Amikaci), אשר יועברו על ידי הסרת נפח מסוים של תרופה 2 ולשים את בארות המקבילה בסט הראשון של צלחות 96-באר המכיל תרופה אחת. השלב השלישי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית (למשל, Levofloxacin), ללוחות המתאימים בסט הראשוני המכיל שילוב של תרופה 1 ו -2. השלב הרביעי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית (למשל, Trimethoprim-sulfamethoxazol) לתוך הצלחות המתאימות במערכה הראשונה. לאחר מכן, אי קולי ESBL אינוקולום חיידקי יהיה מוכן והוסיף.
שיטה זו חשובה כדי להעריך את כל השילובים האפשריים ויש לו מגוון רחב יותר של אפשרויות להיבדק יתר על כן עבור בדיקות vivo. למרות היותו טכניקה מעייפת הדורשת הרבה מיקוד, התוצאות הן מדהימות וחיסכון בזמן שבו הרבה שילובים ניתן לבחון בניסוי אחד.
Introduction
עם העלייה בהתנגדות עקב שימוש יתר ושימוש לרעה שלאנטיביוטיקה 1,2, הצורך לפתח תרופות חדשות וסוכנים לטיפול בזיהומים חיידקיים הפך חיוני. גישות חדשות כגון פיתוח תרופות חדשות חשובות מאוד כדי להתגבר על משבר ההתנגדות. עם זאת, תעשיית התרופות אינה מעוניינת לפתח סוכנים מיקרוביאלית חדשים. יתר על כן, אם תרופות חדשות מפותחות, חיידקים ימשיכו להתפתח ולפתח עמידות נגד תרופות חדשות אלה3,4. לכן, בעיית ההתנגדות לא תיפתר, מה שהופך את הצורך בגישה אחרת חובה שיש לשקול וללמוד כדי להתגבר על עמידות חיידקים.
שילוב תרופות הוא מושג חשוב מאוד לטיפול בזיהומים חיידקיים בעיקר אלה הנגרמים על ידי פתוגנים עמידים multidrug5,6. זה מקטין את מהלך הטיפול, מקטין את המינון שניתן; לכן, הפחתת הרעילות של התרופה הנתונה, מסייעת בהפחתת קצב התפתחות ההתנגדות, ובמובן מסוים, רגישה את החיידקים לתרופות הנתונות כמתואר במושג רגישות בטחונות5,7,8,9.
פיתוח התנגדות לתרופה אחת דורש מוטציה אחת; עם זאת, פיתוח ההתנגדות לשילוב של תרופות המכוונות למסלולים מרובים דורש מספר מוטציות עצמאיות המואטות על ידי שילוב זה. דוגמה לירידה בהתנגדות בעת שימוש בטיפול משולב היא ירידה בשיעור ההתנגדות לריפאמפין בשחפת מיקובקטריום10. דוגמה נוספת היא מחקר שנעשה על ידי Gribble et al. שהראה את קצב הופעתם של זנים עמידים בחולים הנוטלים פייפרצילין לבד להיות גבוה יותר מאשר אלה הנוטלים שילוב של carboxypenicillin ו aminoglycoside10. מחקרים הראו כי התפתחות ההתנגדות aminoglycosides בחיידקים מתפתחים עשה זנים אלה רגישים לתרופות שונות אחרות5. השילוב בין אמוקסיצילין תרופה ברמה בטא לקטם לבין חומצה clavulanic מעכב לקטמה הראההצלחהבטיפול זנים חיידקיים עמידים 8 .
הפחתת זמן הטיפול היא יתרון טוב הנובע משילובי תרופות. לדוגמה, טיפול של פניצילין משולב או ceftriaxone עם gentamicin במשך 2 שבועות ייתן את אותה יעילות שניתנה על ידי פניצילין או ceftriaxone לבד כאשר ניתנת במשך 4 שבועות11. שילוב תרופות מאפשר שימוש במינונים נמוכים יותר של תרופות שאינן יעילות כאשר ניתנות לבד כגון תת MICs. הדוגמה של sulfonamides ניתן לתת שבו השימוש של sulfonamides משולש ממזער, במינונים נמוכים יותר, הרעילות המיוצרת שהיא היווצרות גביש או crystalluria בעת שימוש sulfonamides מסיס במינונים מלאים12.
לכן, הפחתת המינון שניתן ואת זמן הטיפול בסופו של דבר להקטין את הרעילות של התרופות על הגוף. הרעיון של פיתוח שיטות להערכת האינטראקציה בין תרופות משולבות חשוב מאוד. במחקר אחד, התוצאות הראו כי טיפול משולב יעיל יותר לטיפול במינים עמידים של Acinetobacter ו P. aeruginosa8.
מתן תרופות בשילוב
ישנן שיטות שונות שבאמצעותן אנו יכולים ללמוד שילובי תרופות, כגון שיטת לוח השחמט, שיטת עקומת זמן להרוג, ואת שיטת E-test13. שיטת לוח השחמט יכולה לחקור את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות המדוברות בניסוי אחד עצמו. בנוסף, הוא פותח כדי ללמוד שילוב של שלוש תרופות14. עכשיו, אנו מרחיבים את זה כדי ללמוד שילוב של ארבע תרופות בעיקר לטיפול של פתוגנים עמידים multidrug.
הבדיקה עקומת להרוג זמן מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את ההשפעה bactericidal של תרופה מסוימת. זה שימש גם כדי לבדוק את ההשפעה של שילובי סמים שבו מספר תרופות משולבות בריכוזים ספציפיים. פרוטוקול זה דורש הכנה של כמה צינורות סטריליים או כוסות שבו בכל אנו מוסיפים את המרק, שילוב של תרופות, ואת הזן החיידקי הנדרש. לאחר הדגירה והרישום של הצפיפות האופטית במספר נקודות זמן, התוצאות מושוות לקצב הצמיחה הרגיל של הזן המשומש כדי לראות אם קצב הצמיחה גדל, ירד או לא השתנה13.
שיטת בדיקה אלקטרונית נעשית בדרך כלל כדי לבדוק את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) שבו רצועה המכילה ריכוז שיפוע של התרופה המדוברת הוא לשים על צלחת מחוסן. זה שימש גם כדי לבדוק את השילוב בין שתי תרופות שבו שתי רצועות מתווספים לצלחת באופן ניצב מצטלבים ב MICs שלהם13.
על פי הספרות, אין תקן זהב להגדיר וללמוד סינרגיה; לכן, קשה להעריך איזו מהשיטות המשמשות ללימוד שילוב היא טובה יותר ואיזה מהם מייצר תוצאות טובות ואמינות יותר בעיקר13. עם זאת, זמן להרוג assay הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ויקר15,16, בעוד שיטת E-test מפותחת ללמוד שילוב בין שתי תרופות בלבד. Checkerboard יכול ללמוד את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות שנבדקו ולכן טכניקה זו נבחרה להיות מפותחת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת לוח השחמט המרובע דומה ללוח השחמט ולוח השחמט התלת-ממדי בפרוטוקול שלו. עם זאת, יש לקחת בחשבון צעדים חיוניים מסוימים כדי למנוע שגיאות במהלך הניסוי.
הקפד לבדוק את ה- MIC של כל תרופה נגד איזולט נבדק לפני תחילת הפרוטוקול כדי לדעת מה הם הריכוזים הדרושים כדי להתחיל את הדילול עם תר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
