Cuádruple-Checkerboard: Una modificación del tablero de ajedrez tridimensional para el estudio de combinaciones de drogas
Summary
Este protocolo describe cómo estudiar todas las combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un solo experimento. Este método se basa en el ensayo estándar de micro dilución de placas de 96 pozos y el cálculo de concentraciones inhibitorias fraccionadas (FICs) para evaluar los resultados.
Abstract
El concepto de terapia de combinación de fármacos se está volviendo muy importante principalmente con el aumento drástico de la resistencia a los medicamentos. El tablero de ajedrez cuádruple, también llamado tablero Q, tiene como objetivo maximizar el número de combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un experimento para minimizar el tiempo y el trabajo necesarios para lograr los mismos resultados con otros protocolos. Este protocolo se basa en la técnica de micro dilución simple donde los fármacos se diluyen y se combinan en varias placas de 96 pozos.
En el primer conjunto de placas de 96 pozos, se agrega caldo Muller-Hinton seguido del primer medicamento requerido (por ejemplo, cefotaxima aquí) para diluirlo en serie. Una vez realizado el primer paso, se utiliza otro conjunto de placas de 96 pozos para diluir el segundo fármaco (por ejemplo, Amikaci), que se transferirá eliminando un volumen específico de fármaco 2 y se colocará en los pozos correspondientes en el primer conjunto de placas de 96 pozos que contiene el fármaco uno. El tercer paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la tercera droga (por ejemplo, Levofloxacina), a las placas apropiadas en el conjunto inicial que contiene la combinación de la droga 1 y 2. El cuarto paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la cuarta droga (por ejemplo, Trimetoprima-sulfametoxazol) en las placas apropiadas en el primer conjunto. Luego, se preparará y agregará el inóculo bacteriano E. coli ESBL.
Este método es importante para evaluar todas las combinaciones posibles y tiene una gama más amplia de posibilidades para ser probado además para pruebas in vivo. A pesar de ser una técnica agotadora que requiere mucho enfoque, los resultados son notables y ahorran tiempo donde se pueden probar muchas combinaciones en un solo experimento.
Introduction
Con el aumento de la resistencia debido al uso excesivo y mal uso de los antibióticos1,2, la necesidad de desarrollar nuevos fármacos y agentes para tratar las infecciones bacterianas se ha vuelto crucial. Los nuevos enfoques, como el desarrollo de nuevos fármacos, son muy importantes para superar la crisis de resistencia. Sin embargo, la industria farmacéutica no está interesada en desarrollar nuevos agentes antimicrobianos. Además, si se desarrollan nuevos fármacos, las bacterias seguirán evolucionando y desarrollando resistencia contra estos nuevos fármacos3,4. Por lo tanto, el problema de la resistencia no se resolverá, por lo que la necesidad de otro enfoque es una necesidad que debe ser considerado y estudiado para superar la resistencia bacteriana.
La combinación de fármacos es un concepto muy importante para el tratamiento de las infecciones bacterianas, principalmente aquellas que son causadas por patógenos multirresistentes5,6. Disminuye el curso del tratamiento, disminuye la dosis administrada; así, disminuyendo la toxicidad del fármaco dado, ayuda a disminuir la tasa de desarrollo de resistencia y, de alguna manera, sensibiliza a las bacterias a los fármacos dados como se describe en el concepto de sensibilidad colateral5,7,8,9.
El desarrollo de resistencia a un fármaco requiere una sola mutación; sin embargo, el desarrollo de resistencia a una combinación de fármacos dirigidos a múltiples vías requiere varias mutaciones independientes que se ralentizan por esta combinación. Un ejemplo de disminución de la resistencia durante el uso de la terapia combinada es la disminución de la tasa de resistencia a la rifampicina en Mycobacterium Tuberculosis10. Otro ejemplo es un estudio realizado por Gribble et al. que mostró que la tasa de aparición de cepas resistentes en pacientes que toman Piperacilina sola es mayor que en aquellos que toman una combinación de carboxipenicilina y aminoglucósido10. Los estudios han demostrado que el desarrollo de resistencia a los aminoglucósidos en bacterias en evolución hizo que estas cepas sean sensibles a otros fármacos5. La combinación entre el fármaco de clase beta-lactámico amoxicilina y el inhibidor de la lactamasa ácido clavulánico mostró éxito en el tratamiento de cepas bacterianas resistentes8.
La disminución del tiempo de tratamiento es una buena ventaja resultante de las combinaciones de fármacos. Por ejemplo, una terapia de penicilina o ceftriaxona combinada con gentamicina durante 2 semanas dará la misma eficacia dada por penicilina o ceftriaxona sola cuando se administra durante 4 semanas11. La combinación de fármacos permite el uso de dosis más bajas de fármacos que no son eficaces cuando se administran solos, como los Sub-MICs. El ejemplo de sulfonamidas puede darse cuando el uso de triples sulfonamidas minimiza, a dosis más bajas, la toxicidad producida que es la formación de cristales o cristaluria al utilizar sulfonamidas insolubles a dosis completas12.
Por lo tanto, la disminución de la dosis dada y el tiempo de tratamiento eventualmente disminuirá la toxicidad de los medicamentos en el cuerpo. La idea de desarrollar métodos para evaluar la interacción entre fármacos combinados es muy importante. En un estudio, los resultados mostraron que la terapia combinada es más eficaz para el tratamiento de especies resistentes de Acinetobacter y P. aeruginosa8.
Administrar medicamentos en combinación
Existen diferentes métodos por los que podemos estudiar combinaciones de fármacos, como el método del tablero de ajedrez, el método de la curva de muerte en el tiempo y el método de la prueba electrónica13. El método del tablero de ajedrez puede estudiar todas las combinaciones posibles entre los dos fármacos en cuestión en un solo experimento. Además, se desarrolló para estudiar una combinación de tres fármacos14. Ahora, extendemos esto para estudiar una combinación de cuatro fármacos principalmente para el tratamiento de patógenos multirresistentes.
El ensayo de la curva de tiempo-matanza se realiza generalmente para probar para el efecto bactericida de cierta droga. También se usó para probar el efecto de las combinaciones de fármacos donde se combinan varios fármacos a concentraciones específicas. Este protocolo requiere la preparación de varios tubos o tazas estériles donde en cada taza añadimos el caldo, la combinación de fármacos y la cepa bacteriana requerida. Después de la incubación y registro de la densidad óptica en varios puntos de tiempo, los resultados se comparan con la tasa de crecimiento normal de la cepa utilizada para ver si la tasa de crecimiento aumentó, disminuyó o nocambió 13.
El método de la E-prueba se hace generalmente para probar para la concentración inhibitoria mínima (MIC) donde una tira que contiene una concentración del gradiente de la droga en cuestión se pone en una placa inoculada. También se utilizó para probar la combinación entre dos fármacos donde se añaden dos tiras a la placa de forma perpendicular intersectándose en sus MICs13.
Según la literatura, no existe un patrón oro para definir y estudiar la sinergia; por lo tanto, es difícil evaluar cuál de los métodos utilizados para estudiar la combinación es mejor y cuál produce mejores y más confiables resultados principalmente13. Sin embargo, el ensayo time-kill es intensivo en mano de obra, consume mucho tiempo y es costoso15,16,mientras que el método de prueba E se desarrolla para estudiar una combinación entre dos fármacos solamente. El tablero de ajedrez puede estudiar todas las combinaciones posibles entre los dos fármacos probados y es por eso que se ha elegido desarrollar esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método quadruple checkerboard se asemeja al checkerboard y al checkerboard tridimensional en su protocolo. Sin embargo, se deben tener en cuenta ciertos pasos cruciales para evitar errores durante el experimento.
Asegúrese de probar para el MIC de cada droga contra el aislante probado antes de comenzar el protocolo para saber cuáles son las concentraciones que se necesitan para comenzar las diluciones con para la droga 1 y la droga 2 que necesitan ser diluidas en serie en las placas. Con…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ninguno.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
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