Quadruple-Checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties
Summary
Dit protocol beschrijft hoe alle mogelijke combinaties kunnen worden bestudeerd die kunnen worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment. Deze methode is gebaseerd op de standaard 96-well plate micro verdunningstest en de berekening van fractionele remmende concentraties (FIC’s) om de resultaten te evalueren.
Abstract
Het concept van medicamenteuze combinatietherapie wordt vooral erg belangrijk met de drastische toename van de resistentie tegen geneesmiddelen. Het viervoudige dambord, ook wel het Q-dambord genoemd, is gericht op het maximaliseren van het aantal mogelijke combinaties dat kan worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment om de tijd en het werk te minimaliseren dat nodig is om dezelfde resultaten met andere protocollen te bereiken. Dit protocol is gebaseerd op de eenvoudige microverdunningstechniek waarbij de geneesmiddelen worden verdund en gecombineerd in verschillende 96-putplaten.
In de eerste set van 96-put platen wordt Muller-Hinton bouillon toegevoegd, gevolgd door het eerste vereiste medicijn (bijv. Cefotaxime hier) om het serieel te verdunnen. Nadat de eerste stap is voltooid, wordt een andere set 96-putplaten gebruikt om het tweede medicijn te verdunnen (bijv. Amikaci), dat zal worden overgedragen door een specifiek volume van medicijn 2 te verwijderen en in de overeenkomstige putten te plaatsen in de eerste set van 96-putplaten die medicijn één bevatten. De derde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het derde geneesmiddel (bijv. Levofloxacine) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set met combinatie van geneesmiddel 1 en 2. De vierde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het vierde geneesmiddel (bijv. Trimethoprim-sulfamethoxazol) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set. Vervolgens wordt E. coli ESBL bacterieel entmateriaal bereid en toegevoegd.
Deze methode is belangrijk om alle mogelijke combinaties te evalueren en heeft een breder scala aan mogelijkheden om verder te testen voor in vivo testen. Ondanks dat het een vermoeiende techniek is die veel focus vereist, zijn de resultaten opmerkelijk en tijdbesparend waar veel combinaties in één experiment kunnen worden getest.
Introduction
Met de toename van resistentie als gevolg van overmatig gebruik en misbruik van antibiotica1,2, is de noodzaak om nieuwe medicijnen en middelen te ontwikkelen om bacteriële infecties te behandelen cruciaal geworden. Nieuwe benaderingen zoals de ontwikkeling van nieuwe medicijnen zijn erg belangrijk om de weerstandscrisis te overwinnen. De farmaceutische industrie is echter niet geïnteresseerd in de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële middelen. Bovendien, als nieuwe geneesmiddelen worden ontwikkeld, zullen bacteriën blijven evolueren en resistentie ontwikkelen tegen deze nieuwe geneesmiddelen3,4. Het probleem van resistentie zal dus niet worden opgelost, waardoor de noodzaak van een andere aanpak een must is die moet worden overwogen en bestudeerd om bacteriële resistentie te overwinnen.
Medicijncombinatie is een zeer belangrijk concept voor de behandeling van bacteriële infecties, voornamelijk die welke worden veroorzaakt door multidrug resistente pathogenen5,6. Het vermindert het verloop van de behandeling, verlaagt de gegeven dosis; dus, het verminderen van de toxiciteit van het gegeven geneesmiddel, helpt bij het verminderen van de snelheid van resistentieontwikkeling en sensibiliseert in zekere zin de bacteriën voor de gegeven geneesmiddelen zoals beschreven in het concept van collaterale gevoeligheid5,7,8,9.
Resistentieontwikkeling tegen één medicijn vereist één mutatie; resistentieontwikkeling tegen een combinatie van geneesmiddelen gericht op meerdere trajecten vereist echter verschillende onafhankelijke mutaties die door deze combinatie worden vertraagd. Een voorbeeld van verminderde resistentie tijdens het gebruik van combinatietherapie is de verminderde weerstand tegen Rifampine bij Mycobacterium Tuberculosis10. Een ander voorbeeld is een studie uitgevoerd door Gribble et al. die aantoonde dat de snelheid van opkomst van resistente stammen bij patiënten die Piperacilline alleen nemen hoger is dan bij patiënten die een combinatie van carboxypenicilline en aminoglycoside10nemen . Studies hebben aangetoond dat resistentieontwikkeling tegen aminoglycosides in evoluerende bacteriën deze stammen gevoelig maakte voor verschillende andere geneesmiddelen5. De combinatie tussen het bèta-lactamklasse geneesmiddel amoxicilline en de lactamaseremmer clavulaanzuur toonde succes bij de behandeling van resistente bacteriestammen8.
Het verminderen van de behandelingstijd is een goed voordeel als gevolg van medicijncombinaties. Bijvoorbeeld, een therapie van gecombineerde penicilline of ceftriaxon met gentamicine gedurende 2 weken zal dezelfde werkzaamheid geven die alleen door penicilline of ceftriaxon wordt gegeven wanneer het gedurende 4 weken wordt gegeven11. Het combineren van geneesmiddelen maakt het gebruik van lagere doseringen van geneesmiddelen mogelijk die niet effectief zijn wanneer ze alleen worden gegeven, zoals de Sub-MICs. Het voorbeeld van sulfonamiden kan worden gegeven wanneer het gebruik van triple-sulfonamiden bij lagere doses de geproduceerde toxiciteit minimaliseert, namelijk kristalvorming of kristalurie bij gebruik van onoplosbare sulfonamiden in volledige doses12.
Dus, het verlagen van de gegeven dosering en het tijdstip van de behandeling zal uiteindelijk de toxiciteit van de geneesmiddelen op het lichaam verminderen. Het idee om methoden te ontwikkelen om de interactie tussen gecombineerde geneesmiddelen te beoordelen is erg belangrijk. In één studie toonden de resultaten aan dat combinatietherapie effectiever is voor de behandeling van resistente soorten Acinetobacter en P. aeruginosa8.
Het geven van drugs in combinatie
Er zijn verschillende methoden waarmee we medicijncombinaties kunnen bestuderen, zoals de dambordmethode, de tijddodingscurvemethode en de E-testmethode13. De dambordmethode kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geneesmiddelen in kwestie in één experiment zelf bestuderen. Bovendien werd het ontwikkeld om een combinatie van drie geneesmiddelen te bestuderen14. Nu breiden we dit uit om een combinatie van vier geneesmiddelen te bestuderen, voornamelijk voor de behandeling van multidrug-resistente pathogenen.
De time-kill curve assay wordt meestal uitgevoerd om te testen op het bacteriedodende effect van een bepaald medicijn. Het werd ook gebruikt om te testen op het effect van drugscombinaties waarbij verschillende geneesmiddelen in specifieke concentraties worden gecombineerd. Dit protocol vereist de bereiding van verschillende steriele buizen of kopjes waar we in elke beker de bouillon, combinatie van medicijnen en de vereiste bacteriële stam toevoegen. Na incubatie en registratie van de optische dichtheid op verschillende tijdstippen, worden de resultaten vergeleken met de normale groeisnelheid van de gebruikte stam om te zien of de groeisnelheid is toegenomen, afgenomen of niet is veranderd13.
E-testmethode wordt gewoonlijk uitgevoerd om te testen op de minimale remmende concentratie (MIC) waarbij een strip met een gradiëntconcentratie van het geneesmiddel in kwestie op een ingeënte plaat wordt geplaatst. Het werd ook gebruikt om de combinatie tussen twee geneesmiddelen te testen waarbij twee stroken loodrecht aan de plaat worden toegevoegd die elkaar kruisen op hun MMC’s13.
Volgens de literatuur is er geen gouden standaard om synergie te definiëren en te bestuderen; het is dus moeilijk te beoordelen welke van de methoden die worden gebruikt om de combinatie te bestuderen beter is en welke betere en betrouwbaardere resultaten oplevert, voornamelijk13. Time-kill assay is echter arbeidsintensief, tijdrovend en duur15,16, terwijl de E-testmethode is ontwikkeld om een combinatie tussen slechts twee geneesmiddelen te bestuderen. Checkerboard kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geteste geneesmiddelen bestuderen en daarom is ervoor gekozen om deze techniek te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode Quadruple Checkerboard lijkt op het dambord en het driedimensionale dambord in het protocol. Er moet echter rekening worden gehouden met bepaalde cruciale stappen om fouten tijdens het experiment te voorkomen.
Zorg ervoor dat u voor de MIC van elk geneesmiddel test tegen het geteste isolaat voordat u het protocol start om te weten wat de concentraties zijn die nodig zijn om de verdunningen te starten voor geneesmiddel 1 en medicijn 2 die serieel in de platen moeten worden verdund. W…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
geen.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
