Vierfach-Schachbrett: Eine Modifikation des dreidimensionalen Schachbretts zur Untersuchung von Arzneimittelkombinationen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie alle möglichen Kombinationen untersucht werden können, die zwischen vier Medikamenten in einem einzigen Experiment erhalten werden können. Diese Methode basiert auf dem Standard-96-Well-Platten-Mikroverdünnungsassay und der Berechnung fraktionaler inhibitorischer Konzentrationen (FICs) zur Bewertung der Ergebnisse.
Abstract
Das Konzept der Arzneimittel-Kombinationstherapie gewinnt vor allem mit der drastischen Zunahme der Arzneimittelresistenz an Bedeutung. Das Quadruple Checkerboard, auch Q-Checkerboard genannt, zielt darauf ab, die Anzahl der möglichen Kombinationen zu maximieren, die zwischen vier Medikamenten in einem Experiment erhalten werden können, um die Zeit und Arbeit zu minimieren, die erforderlich sind, um die gleichen Ergebnisse mit anderen Protokollen zu erzielen. Dieses Protokoll basiert auf der einfachen Mikroverdünnungstechnik, bei der die Medikamente verdünnt und in mehreren 96-Well-Platten kombiniert werden.
Im ersten Satz von 96-Well-Platten wird Muller-Hinton-Brühe hinzugefügt, gefolgt von dem ersten erforderlichen Medikament (z. B. Cefotaxim hier), um es seriell zu verdünnen. Nachdem der erste Schritt abgeschlossen ist, wird ein weiterer Satz von 96-Well-Platten verwendet, um das zweite Medikament (z. B. Amikaci) zu verdünnen, das durch Entfernen eines bestimmten Volumens von Medikament 2 übertragen und in die entsprechenden Vertiefungen in den ersten Satz von 96-Well-Platten, die Medikament eins enthalten, gelegt wird. Der dritte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des dritten Arzneimittels (z. B. Levofloxacin) zu den entsprechenden Platten im Ausgangssatz, der die Kombination von Arzneimittel 1 und 2 enthält. Der vierte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des vierten Arzneimittels (z. B. Trimethoprim-Sulfamethoxazol) in die entsprechenden Platten im ersten Satz. Dann wird E. coli ESBL bakterielles Inokum hergestellt und hinzugefügt.
Diese Methode ist wichtig, um alle möglichen Kombinationen zu bewerten und hat ein breiteres Spektrum an Möglichkeiten, die darüber hinaus für In-vivo-Tests getestet werden können. Obwohl es sich um eine ermüdende Technik handelt, die viel Konzentration erfordert, sind die Ergebnisse bemerkenswert und zeitsparend, wo viele Kombinationen in einem einzigen Experiment getestet werden können.
Introduction
Mit der Zunahme der Resistenz aufgrund des übermäßigen Einsatzes und Missbrauchs von Antibiotika1,2ist die Notwendigkeit, neue Medikamente und Mittel zur Behandlung bakterieller Infektionen zu entwickeln, entscheidend geworden. Neue Ansätze wie die Entwicklung neuer Medikamente sind sehr wichtig, um die Resistenzkrise zu überwinden. Die pharmaindustrie ist jedoch nicht daran interessiert, neue antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln. Darüber hinaus werden sich Bakterien, wenn neue Medikamente entwickelt werden, weiterentwickeln und Resistenzen gegen diese neuen Medikamente entwickeln3,4. Somit wird das Problem der Resistenz nicht gelöst, was die Notwendigkeit eines anderen Ansatzes zu einem Muss macht, das in Betracht gezogen und untersucht werden sollte, um bakterielle Resistenzen zu überwinden.
Die Arzneimittelkombination ist ein sehr wichtiges Konzept zur Behandlung bakterieller Infektionen, hauptsächlich solche, die durch multiresistente Erreger verursacht werden5,6. Es verringert den Verlauf der Behandlung, verringert die verabreichte Dosis; So hilft die Verringerung der Toxizität des gegebenen Arzneimittels, die Rate der Resistenzentwicklung zu verringern und sensibilisiert in gewisser Weise die Bakterien für die gegebenen Arzneimittel, wie im Konzept der Kollateralempfindlichkeit5,7,8,9beschrieben .
Die Entwicklung von Resistenzen gegen ein Medikament erfordert eine einzige Mutation; Die Entwicklung von Resistenzen gegen eine Kombination von Medikamenten, die auf mehrere Signalwege abzielen, erfordert jedoch mehrere unabhängige Mutationen, die durch diese Kombination verlangsamt werden. Ein Beispiel für eine verminderte Resistenz während der Kombinationstherapie ist die verminderte Resistenzrate gegen Rifampin bei Mycobacterium Tuberculosis10. Ein weiteres Beispiel ist eine Studie von Gribble et al., die zeigte, dass die Rate des Auftretens resistenter Stämme bei Patienten, die Piperacillin allein einnehmen, höher ist als bei Patienten, die eine Kombination aus Carboxypenicillin und Aminoglycosid10einnehmen. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von Resistenzen gegen Aminoglykoside in sich entwickelnden Bakterien diese Stämme empfindlich gegenüber verschiedenen anderen Medikamenten machte5. Die Kombination zwischen dem Beta-Lactam-Klasse-Medikament Amoxicillin und dem Lactamase-Inhibitor Clavulansäure zeigte Erfolge bei der Behandlung resistenter Bakterienstämme8.
Die Verkürzung der Behandlungszeit ist ein guter Vorteil, der sich aus Arzneimittelkombinationen ergibt. Zum Beispiel wird eine Therapie von kombiniertem Penicillin oder Ceftriaxon mit Gentamicin für 2 Wochen die gleiche Wirksamkeit von Penicillin oder Ceftriaxon allein geben, wenn es für 4 Wochen11gegeben wird. Die Kombination von Medikamenten ermöglicht die Verwendung niedrigerer Dosierungen von Medikamenten, die nicht wirksam sind, wenn sie allein verabreicht werden, wie die Sub-MICs. Das Beispiel von Sulfonamiden kann gegeben werden, wenn die Verwendung von Tripelsulfonamiden bei niedrigeren Dosen die Toxizität minimiert, die bei der Verwendung unlöslicher Sulfonamide in vollen Dosen entsteht12.
So wird die Verringerung der verabreichten Dosierung und der Behandlungszeit schließlich die Toxizität der Medikamente auf dem Körper verringern. Die Idee, Methoden zu entwickeln, um die Wechselwirkung zwischen kombinierten Medikamenten zu bewerten, ist sehr wichtig. In einer Studie zeigten die Ergebnisse, dass die Kombinationstherapie bei der Behandlung resistenter Arten von Acinetobacter und P. aeruginosa wirksamerist8.
Medikamente in Kombination verern
Es gibt verschiedene Methoden, mit denen wir Arzneimittelkombinationen untersuchen können, wie die Schachbrettmethode, die Time-Kill-Kurvenmethode und die E-Testmethode13. Die Schachbrettmethode kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden fraglichen Medikamenten in einem Experiment selbst untersuchen. Darüber hinaus wurde es entwickelt, um eine Kombination von drei Medikamenten14zu untersuchen. Nun erweitern wir dies, um eine Kombination von vier Medikamenten hauptsächlich zur Behandlung von multiresistenten Krankheitserregern zu untersuchen.
Der Time-Kill-Curve-Assay wird normalerweise durchgeführt, um die bakterizide Wirkung eines bestimmten Arzneimittels zu testen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung von Arzneimittelkombinationen zu testen, bei denen mehrere Medikamente in bestimmten Konzentrationen kombiniert werden. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung mehrerer steriler Röhrchen oder Becher, in denen wir in jede Tasse die Brühe, die Kombination von Medikamenten und den erforderlichen Bakterienstamm hinzufügen. Nach Inkubation und Aufzeichnung der optischen Dichte zu mehreren Zeitpunkten werden die Ergebnisse mit der normalen Wachstumsrate der verwendeten Sorte verglichen, um zu sehen, ob die Wachstumsrate zugenommen, abgenommen oder sich nicht verändert hat13.
Die E-Test-Methode wird normalerweise durchgeführt, um auf die minimale hemmende Konzentration (MIC) zu testen, bei der ein Streifen, der eine Gradientenkonzentration des betreffenden Arzneimittels enthält, auf eine geimpfte Platte gelegt wird. Es wurde auch verwendet, um die Kombination zwischen zwei Medikamenten zu testen, bei denen zwei Streifen senkrecht zur Platte hinzugefügt werden, die sich an ihren MICs13schneiden.
Laut Literatur gibt es keinen Goldstandard, um Synergien zu definieren und zu untersuchen; Daher ist es schwierig zu beurteilen, welche der Methoden, die zur Untersuchung der Kombination verwendet werden, besser ist und welche bessere und zuverlässigere Ergebnisse liefert, hauptsächlich13. Der Time-Kill-Assay ist jedoch arbeitsintensiv, zeitaufwendig und teuer15,16, während die E-Test-Methode entwickelt wurde, um nur eine Kombination zwischen zwei Medikamenten zu untersuchen. Checkerboard kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden getesteten Medikamenten untersuchen und deshalb wurde diese Technik ausgewählt, um entwickelt zu werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Quadruple Checkerboard-Methode ähnelt in ihrem Protokoll dem Schachbrett und dem dreidimensionalen Schachbrett. Es sollten jedoch bestimmte entscheidende Schritte berücksichtigt werden, um Fehler während des Experiments zu vermeiden.
Stellen Sie sicher, dass Sie das MIC jedes Arzneimittels gegen das getestete Isolat testen, bevor Sie das Protokoll starten, um zu wissen, welche Konzentrationen erforderlich sind, um die Verdünnungen für Medikament 1 und Medikament 2 zu starten, die in d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
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