4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形
Summary
このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。
Abstract
薬物併用療法の概念は、主に薬剤に対する耐性の急激な増加に伴って非常に重要になってきています。Qチェッカーボードとも呼ばれる4倍のチェッカーボードは、他のプロトコルと同じ結果を達成するために必要な時間と作業を最小限に抑えるために、1つの実験で4つの薬物の間で得ることができる可能な組み合わせの数を最大化することを目的としています。このプロトコルは、薬物を希釈し、いくつかの96ウェルプレートで一緒に組み合わせる単純なマイクロ希釈技術に基づいています。
96ウェルプレートの最初のセットでは、ミュラー・ヒントンスープが追加され、その後に最初に必要な薬物(例えば、Cefotaximeはここで)を連続的に希釈する。最初のステップが完了した後、別の96ウェルプレートのセットが第2の薬物(例えば、アミカチ)を希釈するために使用され、これは特定の量の薬物2を除去することによって移され、薬物1を含む96ウェルプレートの最初のセットの対応する井戸に入れられます。第3のステップは、第3の薬物(例えば、レボフロキサシン)の必要な濃度を、薬物1および2の組み合わせを含む初期セットの適切なプレートに添加することによって行われる。第4のステップは、第1セットの適切なプレートに第4の薬物(例えば、トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の必要な濃度を加えることによって行われる。次に、 大腸菌 ESBL細菌接種を調製し、添加する。
この方法は、すべての可能な組み合わせを評価するために重要であり、さらに in vivo テストのためにテストされる可能性の広い範囲を有する。多くの焦点を必要とする疲れた技術であるにもかかわらず、結果は顕著であり、多くの組み合わせを単一の実験でテストできる時間を節約します。
Introduction
抗生物質1,2の過剰使用や誤用による耐性の増加に伴い、細菌感染を治療するための新薬や薬剤の開発が非常に重要になっています。新薬開発などの新しいアプローチは、抵抗危機を克服するために非常に重要です。しかし、製薬業界は新しい抗菌剤の開発には関心がありません。さらに、新薬が開発されれば、細菌はこれらの新薬3,4に対する耐性を進化し、開発し続けるだろう。したがって、抵抗の問題は解決されず、細菌耐性を克服するために考慮され、研究されるべき別のアプローチの必要性を作る。
薬物の組み合わせは、主に多剤耐性病原体5、6によって引き起こされる細菌感染症を治療するための非常に重要な概念である。それは治療の経過を減少させる、与えられた用量を減少させる;したがって、与えられた薬物の毒性を減少させ、抵抗性の発生率を低下させるのに役立ち、そしてある意味では、担保感受性5、7、8、9の概念に記載されているように、与えられた薬剤に細菌を感作する。
1つの薬剤に対する耐性の開発は、単一の突然変異を必要とします;しかし、複数の経路を標的とする薬物の組み合わせに対する耐性の開発には、この組み合わせによって減速されるいくつかの独立した突然変異が必要である。併用療法を使用する間の抵抗の低下の一例は、結核菌10におけるリバンフィンに対する抵抗率の低下である。別の例は、ピペラシリンを単独で服用している患者において抵抗性株の出現率がカルボキシペニシリンとアミノグリコシド10との組み合わせを服用したものよりも高いことを示したGribbleららの研究である。研究は、進化する細菌におけるアミノグリコシドへの耐性の発達がこれらの株を様々な他の薬物に敏感にしたことを示している5。β-ラクタム級薬物アモキシシリンとラクタマーゼ阻害剤のクラクタマーゼ阻害剤との組合せは、耐性菌株8の治療に成功を示した。
治療時間を短縮することは、薬物の組み合わせから生じる良い利点です。例えば、2週間のジェンタマイシンとペニシリンまたはセフトリアキシンを併用する療法は、ペニシリンまたはセフトリアキシン単独で与えられる同じ効力を与える。併用薬は、サブICのような単独で与えられた場合に有効ではない薬物の低用量の使用を可能にする。スルホンアミドの例は、トリプルスルホンアミドの使用が最小限に抑えられるところに、より低い用量で、全用量で不溶性スルホンアミドを使用する場合に結晶形成または結晶化物である毒性を与えることができる。
したがって、与えられた投与量と治療時間を減らすことは、最終的に体内の薬物の毒性を減少させる。併用薬物間の相互作用を評価する方法を開発するという考え方は非常に重要です。ある研究では、併用療法がアシネトバクターおよびP.緑素吸砂の耐性種の治療に対してより効果的であることを示した。
併用して薬を与える
チェッカーボード法、タイムキル曲線法、Eテスト法13など、薬物の組み合わせを調べることができる方法は様々です。チェッカーボード法は、1つの実験自体で問題の2つの薬物の間のすべての可能な組み合わせを研究することができます。また、3つの薬剤14の組み合わせを研究するために開発された。現在、これを拡張して、主に多剤耐性病原体の治療のための4つの薬剤の組み合わせを研究しています。
タイムキル曲線アッセイは、通常、ある薬剤の殺菌効果を試験するために行われる。また、いくつかの薬物が特定の濃度で組み合わされる薬物の組み合わせの効果をテストするために使用されました。このプロトコルは、各カップに我々は、スープ、薬物の組み合わせ、および必要な細菌株を追加するいくつかの無菌チューブまたはカップの調製を必要とする。いくつかの時点で光学密度のインキュベーションと記録後、その結果を、使用された菌株の正常な成長率と比較して、増殖速度が増加したか、減少したか、または13を変化させなかったかを調べる。
E-test法は、通常、対象の薬物の勾配濃度を含むストリップが接種されたプレート上に置かれている最小の阻害濃度(MIC)を試験するために行われる。また、2つのストリップが彼らのMCS13で交差する垂直な方法でプレートに追加される2つの薬物の組み合わせをテストするために使用されました。
文献によれば、相乗効果を定義し、研究するためのゴールドスタンダードはありません。したがって、組み合わせを研究するために使用される方法のどれがより良く、どれがより良く、より信頼性の高い結果を主に13を生成するかを評価することは困難です。しかし、時間殺しの検定は、労働集約的で時間がかかり、高価な15,16であり、Eテスト法は2つの薬物の組み合わせを研究するために開発される。チェッカーボードは、テストされた2つの薬物間のすべての可能な組み合わせを研究することができ、これがこの技術が開発するために選択された理由です。
Protocol
Representative Results
Discussion
4倍のチェッカーボード法は、そのプロトコルのチェッカーボードと3次元チェッカーボードに似ています。ただし、実験中のエラーを避けるために、特定の重要な手順を考慮する必要があります。
試験された分離株に対して各薬物のMICをテストし、プレートで連続希釈する必要がある薬物1および薬物2の希釈を開始するために必要な濃度を知るためにプロトコルを開始し?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
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