쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정
Summary
이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.
Abstract
약물 조합 요법의 개념은 주로 약물에 대한 저항의 급격한 증가와 함께 매우 중요해지고 있습니다. Q-checkerboard라고도 하는 Quadruple 체커보드는 다른 프로토콜과 동일한 결과를 달성하는 데 필요한 시간과 작업을 최소화하기 위해 한 실험에서 4개의 약물 간에 얻을 수 있는 가능한 조합수를 극대화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 약물이 희석되고 여러 96 웰 플레이트에서 함께 결합되는 간단한 마이크로 희석 기술을 기반으로합니다.
96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 뮬러-힌튼 국물은 첫 번째 필수 약물(예: Cefotaxime)이 잇따라 첨가되어 이를 연속적으로 희석시합니다. 첫 번째 단계가 완료된 후, 또 다른 96웰 플레이트 세트는 제2약물(예를 들어, 아미카시)을 희석하여 약물 2의 특정 부피를 제거하고 약물을 포함하는 96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 해당 우물에 넣는데 사용된다. 제3단계는 제3약물(예를 들어, 레보플로색사신)의 필요한 농도를 약물 1과 2의 조합을 포함하는 초기 세트의 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행된다. 네 번째 단계는 제 4 약물의 필요한 농도(예를 들어, 트리메토림-설페마페스옥사졸)를 첫 번째 세트에서 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행됩니다. 이어서, 대장균 ESBL 세균성 접종이 준비되고 추가될 것이다.
이 방법은 가능한 모든 조합을 평가하는 것이 중요하며 생체 내 테스트를 위해 더 넓은 범위의 테스트를 테스트할 수 있습니다. 많은 초점을 필요로하는 피곤한 기술임에도 불구하고, 결과는 하나의 실험에서 많은 조합을 테스트 할 수있는 놀라운 시간 절약이다.
Introduction
항생제1,2의남용 과용 및 오용으로 인한 저항의 증가와 함께 세균 감염을 치료하기 위한 신약 및 제제를 개발할 필요성이 결정적입니다. 신약 개발과 같은 새로운 접근법은 저항 위기를 극복하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 제약 산업은 새로운 항균제 개발에 관심이 없습니다. 더욱이, 신약이 개발되면 박테리아는 이러한신약3,4에대한 저항을 계속 진화하고 개발할 것이다. 따라서, 저항의 문제는 해결되지 않을 것입니다, 다른 접근에 대한 필요성을 고려하고 세균성 저항을 극복하기 위해 연구해야한다.
약물 조합은 주로 다약물 내성 병원균5,6에의해 유발되는 세균 성 감염을 치료하기위한 매우 중요한 개념이다. 그것은 치료의 과정을 감소, 주어진 복용량을 감소; 따라서, 주어진 약물의 독성을 감소시키고, 저항성의 발병속도를 낮추는 데 도움이 되며, 어떤 면에서, 담보 민감도5,7,8,9의개념에 기술된 바와 같이 주어진 약물에 박테리아를 민감하게 한다.
하나의 약물에 대한 저항 발달은 단일 돌연변이를 필요로한다; 그러나, 여러 경로를 대상으로 하는 약물의 조합에 저항 개발이 조합에 의해 둔화 되는 몇 가지 독립적인 돌연변이 필요. 병용 요법을 사용 하 여 저항감소하는 예는 골균결핵(10)에서리팜핀에 대한 저항률이 감소한다. 또 다른 예는 Gribble 외에 의해 수행 된 연구입니다. 연구 결과에 따르면 진화하는 박테리아에서 아미노글리코사이드에 대한 저항 발달은 이러한 균주를 다양한 다른 약물에 민감하게 만들었습니다5. 베타락탐급 약물 아목시실린과 락타마제 억제제 클라불란산의 조합은 내성세균균제8치료에 성공한 것으로 나타났다.
치료 시간을 줄이는 것은 약물 조합으로 인한 좋은 이점입니다. 예를 들어, 2주 동안 겐타미신을 가진 결합된 페니실린 또는 세프트리악손의 치료는 4주11에주어지면 페니실린 또는 세프트리악손만이 주어지는 것과 동일한 효능을 부여한다. 약물을 결합하면 하위 MiC와 같이 단독으로 투여 될 때 효과적이지 않은 약물의 낮은 복용량을 사용할 수 있습니다. 설포나미드의 예는 삼중 설포나미드의 사용이 최소화되는 경우, 더 낮은 용량으로, 완전투여량12에서불용성 설포나미드를 사용할 때 결정 형성 또는 결정성루리아인 독성을 최소화할 수 있다.
따라서 주어진 복용량과 치료 시간을 줄이면 결국 신체의 약물의 독성이 감소합니다. 결합된 약 사이 상호 작용을 평가하는 방법을 개발하는 아이디어는 아주 중요합니다. 한 연구에서는, 결과는 조합 치료가 아신토박터와 P. aeruginosa8의저항하는 종의 처리를 위해 더 효과적이다는 것을 보여주었습니다.
조합하여 약물을 제공
체크보드 방법, 시간 kill 곡선 방법 및 E-test방법(13)과같은 약물 조합을 연구할 수 있는 다른 방법이 있다. 체크 보드 방법은 하나의 실험 자체에서 문제의 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구 할 수 있습니다. 또한, 3개의약물(14)의조합을 연구하기 위해 개발되었다. 지금, 우리는 주로 다제 내성 병원균의 처리를 위한 4개의 약의 조합을 연구하기 위하여 이것을 확장합니다.
시간 살인 곡선 분석법은 일반적으로 특정 약물의 bactericidal 효과에 대한 테스트 수행. 그것은 또한 여러 약물 특정 농도에서 결합 되는 약물 조합의 효과 대 한 테스트 에 사용 되었다. 이 프로토콜은 각 컵에서 국물, 약물의 조합 및 필요한 세균균을 추가하는 여러 멸균 튜브 또는 컵의 준비를 필요로합니다. 여러 시점에서 광학 밀도의 인큐베이션 및 기록 후, 결과는 사용 된 균주의 정상 성장 속도와 비교하여 성장 속도가 증가, 감소 또는13을변경하지 않았는지 여부를 확인합니다.
전자시험방법은 일반적으로 문제의 약물의 그라데이션 농도를 포함하는 스트립이 접종된 플레이트에 놓이는 최소한의 억제 농도(MIC)를 시험하기 위해 수행됩니다. 또한 두 개의 스트립이 MIC13에서교차하는 수직 방식으로 플레이트에 첨가되는 두 약물 간의 조합을 테스트하는 데 사용되었다.
문학에 따르면, 정의하고 시너지 를 연구하는 금 본위제는 없습니다; 따라서, 조합을 연구하는 데 사용되는 방법 중 어느 것이 더 좋으며 어느 것이 더 좋고 더 신뢰할 수 있는 결과를 주로13을생성하는지 평가하기가 어렵다. 그러나, 시간-살인 분석법은 노동 집약적, 시간 소모,고가의 15,16,E-시험 방법은 두 약물 간의 조합을 연구하기 위해 개발된다. 체커보드는 테스트된 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구할 수 있으며, 이것이 이 기술이 개발되기로 선택된 이유입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
쿼드러플 체커보드 방법은 체커보드와 프로토콜의 3차원 체커보드와 유사합니다. 그러나 실험 중 오류를 방지하기 위해 특정 중요한 단계를 고려해야 합니다.
테스트된 각 약물의 MIC에 대해 테스트해야 하는 프로토콜을 시작하기 전에 플레이트에서 연속적으로 희석되어야 하는 약물 1 및 약물 2에 대한 희석을 시작하는 데 필요한 농도가 무엇인지 알아야 합니다. 약물 3 및 약…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
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