Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci
Summary
Questo protocollo descrive come studiare tutte le possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento. Questo metodo si basa sul saggio standard di micro diluizione a piastre da 96 pozzi e sul calcolo delle concentrazioni inibitorie frazionarie (COV) per valutare i risultati.
Abstract
Il concetto di terapia a combinazione di farmaci sta diventando molto importante principalmente con il drastico aumento della resistenza ai farmaci. La scacchiera Quadruple, chiamata anche Q-checkerboard, mira a massimizzare il numero di possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento per ridurre al minimo il tempo e il lavoro necessari per ottenere gli stessi risultati con altri protocolli. Questo protocollo si basa sulla semplice tecnica di micro diluizione in cui i farmaci vengono diluiti e combinati insieme in diverse piastre da 96 pozzi.
Nel primo set di piastre da 96 pozzi, viene aggiunto brodo Muller-Hinton seguito dal primo farmaco richiesto (ad esempio, Cefotaxime qui) per diluirlo serialmente. Dopo che il primo passo è stato fatto, un altro set di piastre da 96 po ‘viene utilizzato per diluire il secondo farmaco (ad esempio, Amikaci), che verrà trasferito rimuovendo un volume specifico di farmaco 2 e messo nei pozzi corrispondenti nel primo set di piastre a 96 po ‘che contengono il farmaco uno. Il terzo passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del terzo farmaco (ad esempio, Levofloxacina), alle piastre appropriate nel set iniziale contenenti combinazione di farmaco 1 e 2. Il quarto passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del quarto farmaco (ad esempio, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nelle piastre appropriate nel primo set. Quindi, L’inoculo batterico E. coli ESBL verrà preparato e aggiunto.
Questo metodo è importante per valutare tutte le combinazioni possibili e ha una gamma più ampia di possibilità da testare inoltre per i test in vivo. Nonostante sia una tecnica stancante che richiede molta attenzione, i risultati sono notevoli e fanno risparmiare tempo dove molte combinazioni possono essere testate in un singolo esperimento.
Introduction
Con l’aumento della resistenza dovuto all’uso eccessivo e all’uso impropriodi antibiotici 1,2, la necessità di sviluppare nuovi farmaci e agenti per trattare le infezioni batteriche è diventata cruciale. Nuovi approcci come lo sviluppo di nuovi farmaci sono molto importanti per superare la crisi di resistenza. Tuttavia, l’industria farmaceutica non è interessata a sviluppare nuovi agenti antimicrobici. Inoltre, se vengono sviluppati nuovi farmaci, i batteri continuerà a evolversi e sviluppare resistenza contro questi nuovifarmaci 3,4. Pertanto, il problema della resistenza non sarà risolto, rendendo la necessità di un altro approccio un must che dovrebbe essere considerato e studiato per superare la resistenza batterica.
La combinazione di farmaci è un concetto molto importante per il trattamento delle infezioni batteriche principalmente quelle causate da agenti patogeni multifarmaco resistenti5,6. Diminuisce il corso del trattamento, diminuisce la dose somministrata; quindi, diminuendo la tossicità del farmaco dato, aiuta a diminuire il tasso di sviluppo della resistenza e, in un certo senso, sensibilizza i batteri ai farmaci dati come descritto nel concetto di sensibilità collaterale5,7,8,9.
Lo sviluppo della resistenza a un farmaco richiede una singola mutazione; tuttavia, lo sviluppo della resistenza a una combinazione di farmaci mirati a percorsi multipli richiede diverse mutazioni indipendenti che sono rallentate da questa combinazione. Un esempio di diminuzione della resistenza durante l’utilizzo della terapia combinata è la diminuzione del tasso di resistenza a Rifampin in Mycobacterium Tuberculosis10. Un altro esempio è uno studio condotto da Gribble et al. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo di resistenza agli amminoglicosidi nell’evoluzione dei batteri ha reso questi ceppi sensibili a vari altri farmaci5. La combinazione tra il farmaco di classe beta-lattame amoxicillina e l’inibitore della lattamasi acido clavulanico ha mostrato successo nel trattamento di ceppi battericiresistenti 8.
Diminuire il tempo di trattamento è un buon vantaggio derivante dalle combinazioni di farmaci. Ad esempio, una terapia di penicillina combinata o ceftriaxone con gentamicina per 2 settimane darà la stessa efficacia data dalla penicillina o dal ceftriaxone da solo se somministrata per 4 settimane11. La combinazione di farmaci consente l’uso di dosaggi inferiori di farmaci che non sono efficaci se somministrati da soli come i Sub-CCI. L’esempio dei sulfonamidi può essere fornito quando l’uso di tre solfamidi riduce al minimo, a dosi più basse, la tossicità prodotta che è la formazione di cristalli o cristalli quando si utilizzano solfonamidi insolubili a dosicomplete 12.
Pertanto, diminuendo il dosaggio dato e il tempo di trattamento alla fine diminuirà la tossicità dei farmaci sul corpo. L’idea di sviluppare metodi per valutare l’interazione tra farmaci combinati è molto importante. In uno studio, i risultati hanno dimostrato che la terapia combinata è più efficace per il trattamento di specie resistenti di Acinetobacter e P. aeruginosa8.
Dare farmaci in combinazione
Esistono diversi metodi con cui possiamo studiare le combinazioni di farmaci, come il metodo della scacchiera, il metodo della curva di uccisione del tempo e il metodo di test E13. Il metodo della scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci in questione in un unico esperimento stesso. Inoltre, è stato sviluppato per studiare una combinazione di tre farmaci14. Ora, lo estendiamo a studiare una combinazione di quattro farmaci principalmente per il trattamento di agenti patogeni multirrogatori.
Il test della curva di uccisione del tempo viene solitamente eseguito per testare l’effetto battericida di un certo farmaco. È stato anche usato per testare l’effetto delle combinazioni di farmaci in cui diversi farmaci sono combinati a concentrazioni specifiche. Questo protocollo richiede la preparazione di diversi tubi sterili o tazze in cui in ogni tazza aggiungiamo il brodo, la combinazione di farmaci e il ceppo batterico richiesto. Dopo l’incubazione e la registrazione della densità ottica in diversi punti di tempo, i risultati vengono confrontati con il tasso di crescita normale del ceppo utilizzato per vedere se il tasso di crescita è aumentato, diminuito o non ècambiato 13.
Il metodo di prova elettronica viene solitamente eseguito per verificare la concentrazione inibitoria minima (MIC) in cui una striscia contenente una concentrazione gradiente del farmaco in questione viene messa su una piastra inoculata. È stato anche utilizzato per testare la combinazione tra due farmaci in cui due strisce vengono aggiunte alla piastra in modo perpendicolare intersecandosi ai loroCCI 13.
Secondo la letteratura, non esiste un gold standard per definire e studiare la sinergia; pertanto, è difficile valutare quale dei metodi utilizzati per studiare la combinazione sia migliore e quale produca risultati migliori e più affidabili principalmente13. Tuttavia, il test time-kill richiede molto lavoro, richiede molto tempo ecosta 15,16, mentre il metodo di test E viene sviluppato per studiare una combinazione solo tra due farmaci. La scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci testati ed è per questo che questa tecnica è stata scelta per essere sviluppata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo Quadruple Checkerboard assomiglia alla scacchiera e alla scacchiera tridimensionale nel suo protocollo. Tuttavia, si dovrebbero prendere in considerazione alcune misure cruciali per evitare errori durante l’esperimento.
Assicurarsi di testare il MIC di ogni farmaco contro l’isolato testato prima di iniziare il protocollo per sapere quali sono le concentrazioni necessarie per avviare le diluizioni con per il farmaco 1 e il farmaco 2 che devono essere diluiti serialmente nelle piastre….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nessuno.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
Riferimenti
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