Определение общего количества липидов и классов липидов в морских образцах
Summary
Этот протокол предназначен для определения липидов в морской воде и биологических образцах. Липиды в фильтратах экстрагируют хлороформом или смесями хлороформа и метанола в случае твердых веществ. Классы липидов измеряются палочковой тонкослойной хроматографией с обнаружением ионизации пламени и их сумма дает общее содержание липидов.
Abstract
Липиды в значительной степени состоят из углерода и водорода и, следовательно, обеспечивают большую специфическую энергию, чем другие органические макромолекулы в море. Будучи богатыми углеродом и водородом, они также являются гидрофобными и могут выступать в качестве растворителя и абсорбционного носителя органических загрязнителей и, таким образом, могут быть факторами биоаккумуляции загрязнителей в морских экосистемах. Их гидрофобная природа облегчает их изоляцию от морской воды или биологических образцов: анализ морских липидов начинается с отбора проб, а затем экстракции в неполярных органических растворителях, обеспечивая удобный метод их отделения от других веществ в водной матрице.
Если морская вода была отобрана, первый этап обычно включает разделение на функционально определенные «растворенные» и «твердые» фракции путем фильтрации. Образцы собирают и выделяют липиды из матрицы образца, как правило, хлороформом для действительно растворенных веществ и коллоидов, а также смесями хлороформа и метанола для твердых веществ и биологических образцов. Такие экстракты могут содержать несколько классов из биогенных и антропогенных источников. В это время могут быть определены общие липиды и классы липидов. Общий липид может быть измерен путем суммирования индивидуально определенных классов липидов, которые обычно были хроматографически разделены. Тонкослойная хроматография (TLC) с обнаружением пламенной ионизации (FID) регулярно используется для количественного анализа липидов из морских образцов. TLC-FID предоставляет синоптиальную информацию о классе липидов и, путем суммирования классов, общее измерение липидов.
Информация о классе липидов особенно полезна в сочетании с измерениями отдельных компонентов, например, жирных кислот и/или стерилов, после их высвобождения из липидных экстрактов. Широкое разнообразие липидных структур и функций означает, что они широко используются в экологических и биогеохимических исследованиях, оценивающих здоровье экосистем и степень влияния антропогенных воздействий. Они использовались для измерения веществ, имеющих пищевую ценность для морской фауны (например, аквакормы и/или добыча), а также в качестве показателя качества воды (например, углеводороды).
Introduction
Методы, описанные здесь, относятся к веществам, которые функционально определяются как морские липиды. Это определение основано на их поддающейся жидкостно-жидкостной экстракции в неполярных органических растворителях, и обеспечивает удобный способ их отделения от других веществ в водной матрице. Их гидрофобная природа облегчает их изоляцию от морской воды или биологических образцов, а также их обогащение и удаление солей и белков.
Измерение содержания липидов и их состава в морских организмах на протяжении десятилетий представляет большой интерес для экологии пищевой сети, питания аквакультуры и пищевой науки. Липиды являются универсальными компонентами в живых организмах, действуя как необходимые молекулы в клеточных мембранах, как основные источники биодоступной энергии, обеспечивая теплоизоляцию и плавучесть и служа сигнальными молекулами. Хотя процедуры определения липидов в других областях были хорошо описаны, их использование с морскими образцами обычно требует модификации для адаптации к полевым условиям, а также к образцу типа1.
Для проб морской воды на первом этапе обычно требуется разделение на функционально определенные фракции “растворенные” и “твердые частицы”, как правило, путем фильтрации (этап 1 Протокола). Фракция твердых частиц – это то, что удерживается фильтром, и размер пор важен для определения отсечки2. Часто, когда мы отбираем пробы твердых частиц, мы хотели бы соотнести концентрации липидов с общими массовыми концентрациями, и в этом случае для этой цели необходимо взять отдельную, меньшую пробу (например, 10 мл) (этап 1 Протокола, примечание). Для получения точного определения массы важно добавить в конце фильтрации аммианий -формат (35 г/л).
Фильтрат морской воды из более крупного образца должен составлять от 250 мл до 1 л в зависимости от типа образца и подвергается жидкостно-жидкой экстракции в сепараторной воронке (этап протокола 2). Гидрофобная природа липидов означает, что они могут быть отделены от других соединений путем экстракции в неполярном растворителе, таком как хлороформ. Создается двухслойная система, в которой липиды делятся на органический слой, в то время как водорастворимые компоненты остаются в водном слое.
Образцы твердых частиц на фильтре или биологические образцы экстрагируют модифицированным экстракцией Folch et al.3,также включающей хлороформ (этап 3 Протокола). Опять же, создается органическая/водная система, в которой липиды делятся на органическую фазу, в то время как водорастворимые молекулы остаются в водной фазе, а белки осаждаются. Фактически, для твердых веществ большинство лабораторий используют некоторые вариации процедуры экстракции Folch et al.3 с участием хлороформа и метанола. Для фильтров первым шагом является гомогенизация в 2 мл хлороформа и 1 мл метанола.
Во время экстракции следует проявлять осторожность для защиты липидов от химической или ферментативной модификации, сохраняя образцы и растворители на льду для уменьшения гидролиза эфирной связи или окисления углеродно-углеродной двойной связи. Ткани и клеточные липиды довольно хорошо защищены природными антиоксидантами и компартментализацией4; однако после гомогенизации образцов клеточное содержимое объединяется, что делает липиды более склонными к изменению, химически или ферментационно. Некоторые липиды, такие как большинство стеринов, очень стабильны, в то время как другие, такие как те, которые содержат полиненасыщенные жирные кислоты, более восприимчивы к химическому окислению. Другие, такие как стерины с сопряженными двойными связями, склонны к окислению, катализируемого светом5. После экстракции липиды гораздо более восприимчивы к химическому окислению, и образцы должны храниться под инертным газом, таким как азот. Мягкий поток азота также будет использоваться для концентрирования экстрактов.
После концентрации липиды обычно количественно определяются массой, поскольку они являются важным компонентом морских экосистем, обеспечивающим высокую концентрацию энергии, более чем в два раза превышающую кДж/г углеводов и белков. Затем они неизменно будут количественно оцениваться как отдельные компоненты: всесторонний анализ липидов обычно включает разделение на более простые категории в соответствии с их химической природой. Таким образом, полный анализ включает в себя измерение общего количества липидов, классов липидов и отдельных соединений.
Общий липид можно определить, взяв сумму индивидуально измеренных классов липидов, разделенных хроматографией6. Морской липидный экстракт может содержать более десятка классов из биогенных и антропогенных источников. Большое разнообразие липидных структур означает, что большая часть информации может быть получена путем определения отдельных групп структур. Классы липидов по отдельности или в определенных группах использовались для сигнализации присутствия определенных типов организмов, а также их физиологического статуса и активности2. Они также использовались в качестве индикатора происхождения органического материала, включая растворенные органические вещества (DOM), а также гидрофобные загрязнители.
Триацилглицерины, фосфолипиды и стерины являются одними из наиболее важных биогенных классов липидов. Первые два биохимически связаны, поскольку они обладают глицериновой основой, в которую этерифицированы две или три жирные кислоты(рисунок 1). Триацилглицеролы вместе с эфирами воска являются очень важными веществами для хранения, в то время как другие жирокислотсодержащие липидные классы, такие как диацилглицеролы, свободные жирные кислоты и моноацилглицеролы, как правило, являются второстепенными компонентами. Свободные жирные кислоты присутствуют в более низких концентрациях в живых организмах, так как ненасыщенные могут быть токсичными7. Стерины (как в свободной, так и в этерифицированной формах) и жирные спирты также включены в число менее полярных липидов, в то время как гликолипиды и фосфолипиды являются полярными липидами. Полярные липиды имеют гидрофильной группу, которая позволяет формировать липидные бислои, обнаруженные в клеточных мембранах. Свободные стерины также являются мембранными структурными компонентами, и при приеме в соотношении с триацилглицеролами они обеспечивают состояние или питательный индекс (TAG: ST), который широко использовался8. При приеме в соотношении к фосфолипидам (ST: PL) их можно использовать для указания чувствительности растений к соли: более высокие значения сохраняют структурную целостность и снижают проницаемостьмембраны 9. Обратное это соотношение (PL: ST) было изучено в тканях двустворчатых моллюсков во время температурной адаптации10.
Морские липидные классы могут быть разделены с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) на стержнях, покрытых силикагелем (этап протокола 4), а затем обнаружены и количественно определены с помощью обнаружения пламенной ионизации (FID) в автоматическом сканере FID. TLC/FID стал обычно использоваться для морских образцов, поскольку он быстро предоставляет синоптические данные о классе липидов из небольших образцов и, беря сумму всех классов, значение для общего количества липидов. TLC/FID был подвергнут оценке обеспечения качества (QA) и было установлено, что он соответствует стандартам, необходимым для последовательной внешней калибровки, низких заготовок и точного анализа репликации11. Коэффициенты вариации (CV) или относительные стандартные отклонения составляют около 10%, а общие липидные данные сканера FID обычно составляют около 90% от тех, которые получены гравиметрическим и другими методами2. Гравиметрия дает более высокое общее количество липидов, вероятно, потому, что сканер FID измеряет только нелетучие соединения, а также в результате возможного включения нелипидного материала в гравиметрические измерения.
Информация, полученная при анализе класса липидов, особенно полезна в сочетании с определением жирных кислот как отдельных лиц, или стерилов, или двух в комбинации. Первый шаг к этим анализам включает высвобождение всех компонентов жирных кислот вместе со стеринами в липидных экстрактах (этап протокола 5). Широкое разнообразие липидных структур и функций означает, что они широко используются в экологических и биогеохимических исследованиях, оценивающих здоровье экосистем и степень, в которой на них влияют антропогенные и наземные ресурсы. Они использовались для измерения биосинтеза веществ, имеющих диетическое значение для морской фауны, а также для указания качества проб воды. Измерение липидов в образцах керна отложений помогает показать чувствительность отложений к изменениям в землепользовании человека вблизи края суши и моря.
Основным инструментом для идентификации и количественной оценки отдельных липидных соединений традиционно является газовая хроматография (ГХ) с FID. Однако перед анализом эти соединения делаются более летучими путем дериватизации. Жирные кислоты высвобождаются в присутствии кислотного катализатора(Н2SO4)из ациллипидных классов(фиг.1). В органической химии ацильная группа (R-C= O) обычно получается из карбоновой кислоты (R-COOH). Затем они повторно этерифицируются в метиловые эфиры жирных кислот (FAME), что дает лучшее разделение на колонках GC (этап протокола 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Скорость, с которой система TLC-FID предоставляет синоптические данные о классе липидов из небольших образцов, делает TLC-FID способным инструментом для скрининга морских образцов перед проведением более вовлеченных аналитических процедур. Такие анализы обычно требуют высвобождения компо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) под номером гранта 105379 К.C Пэрришу. Сеть Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Мемориального университета помогла финансировать эту публикацию.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
Riferimenti
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
