माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर माउस भ्रूण ऊतक की संस्कृति और हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। पाथवे मॉड्यूलेटर की दालों को लागू करके, इस प्रणाली का उपयोग माउस सोमिटोजेनेसिस की कार्यात्मक जांच के लिए सिग्नलिंग दोलनों को बाहरी रूप से नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है।
एक विकासशील माउस भ्रूण के प्रीसोमिटिक मेसोडर्म का आवधिक विभाजन सिग्नलिंग मार्गों के एक नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है। सिग्नलिंग दोलनों और ग्रेडिएंट को क्रमशः खंड गठन के समय और रिक्ति को नियंत्रित करने के लिए सोचा जाता है। जबकि शामिल सिग्नलिंग मार्गों का पिछले दशकों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करने में सिग्नलिंग दोलनों के कार्य के लिए प्रत्यक्ष सबूत की कमी है। सिग्नलिंग गतिशीलता की कार्यात्मक जांच को सक्षम करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक्स इन गतिशीलता के सूक्ष्म मॉडुलन के लिए पहले से स्थापित उपकरण है। इस माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित entrainment दृष्टिकोण के साथ अंतर्जात सिग्नलिंग दोलनों मार्ग modulators की दालों द्वारा सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं। यह उदाहरण के लिए, दोलन अवधि या दो दोलन मार्गों के बीच चरण-संबंध के मॉडुलन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, मार्ग मॉड्यूलेटर के स्थानिक ग्रेडिएंट को ऊतक के साथ स्थापित किया जा सकता है ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि सिग्नलिंग ग्रेडिएंट में विशिष्ट परिवर्तन सोमिटोजेनेसिस को कैसे प्रभावित करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक्स के पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण स्थापित करने में मदद करने के लिए है। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम स्थापित करने के लिए आवश्यक बुनियादी सिद्धांतों और उपकरणों का वर्णन किया गया है, और एक चिप डिजाइन प्रदान किया जाता है, जिसके साथ चिप पीढ़ी के लिए एक मोल्ड आसानी से 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। अंत में, माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर प्राथमिक माउस ऊतक को कैसे संस्कृति करें और मार्ग मॉड्यूलेटर के बाहरी दालों के लिए सिग्नलिंग दोलनों को कैसे प्रशिक्षित करें, इस पर चर्चा की जाती है।
इस माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली को अन्य संदर्भों में सिग्नलिंग गतिशीलता और मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट की कार्यात्मक जांच के लिए गैस्ट्रुलॉइड्स और ऑर्गेनोइड्स जैसे विवो और इन विट्रो मॉडल सिस्टम में अन्य बंदरगाह के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
विकास सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से अंतरकोशिकीय संचार द्वारा नियंत्रित किया जाता है। केवल सीमित संख्या में सिग्नलिंग मार्ग हैं जो ऊतकों के जटिल गठन और अंतरिक्ष और समय में उचित सेल भेदभाव का आयोजन करते हैं। प्रक्रियाओं की इस भीड़ को विनियमित करने के लिए, जानकारी को सिग्नलिंग मार्ग की गतिशीलता में एन्कोड किया जा सकता है, समय के साथ एक मार्ग का परिवर्तन, जैसे कि सिग्नल 1,2 की आवृत्ति या अवधि।
सोमिटोजेनेसिस के दौरान, सोमिटिक ऊतक को समय-समय पर प्रीसोमिटिक मेसोडर्म (पीएसएम) 3 से विभाजित किया जाता है। PSM स्थानिक रूप से WNT, Fibroblast विकास कारक (FGF), और रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग के gradients द्वारा आयोजित किया जाता है। निर्धारण के मोर्चे पर पूर्वकाल पीएसएम में, जहां WNT और FGF संकेत कम होते हैं, कोशिकाओं को सोमाइट्स में भेदभाव के लिए प्राइम किया जाता है। भेदभाव तब होता है जब ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण की एक लहर इस निर्धारण मोर्चे तक पहुंचती है। PSM के भीतर, WNT, FGF, और पायदान सिग्नलिंग दोलन. पड़ोसी कोशिकाएं चरण से थोड़ा बाहर दोलन करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप डब्ल्यूएनटी, एफजीएफ और नॉच मार्गों के डाउनस्ट्रीम में ऑसिलेटरी ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण की तरंगें होती हैं जो पीछे से पूर्वकाल पीएसएम तक यात्रा करती हैं। माउस भ्रूण में, एक ट्रांसक्रिप्शनल तरंग लगभग हर 2 घंटे में निर्धारण मोर्चे तक पहुंचती है और सोमाइट गठन शुरू करती है। सिग्नलिंग मार्गों को परेशान या सक्रिय करके सोमिटोजेनेसिस का अध्ययन करना इन मार्गों के महत्व को स्पष्ट कर सकता है4,5,6,7,8,9। हालांकि, सेलुलर व्यवहार के नियंत्रण में सिग्नलिंग गतिशीलता के कार्य की जांच करने में सक्षम होने के लिए, स्थायी रूप से सक्रिय करने या उन्हें बाधित करने के बजाय सिग्नलिंग मार्गों को सूक्ष्म रूप से संशोधित करना आवश्यक है।
अस्थायी रूप से माउस भ्रूण को विभाजित करने के भीतर सिग्नलिंग मार्ग गतिविधि को संशोधित करने के लिए, Sonnen et al. ने एक माइक्रोफ्लुइडिक system10 विकसित किया है। यह प्रणाली एक चिप के माइक्रोचैनल के भीतर तरल पदार्थ के प्रवाह के तंग नियंत्रण की अनुमति देती है जिसमें जैविक नमूना 11 होता है। PSM के उचित विभाजन के लिए सिग्नलिंग गतिशीलता के महत्व का अध्ययन करने के लिए, इस माइक्रोफ्लुइडिक्स सेटअप का उपयोग माउस विभाजन घड़ी पूर्व विवो की सिग्नलिंग गतिशीलता को संशोधित करने के लिए किया जाता है। संस्कृति कक्ष में क्रमिक रूप से मार्ग उत्प्रेरक या अवरोधकों को स्पंदित करके, WNT, FGF, और Notch सिग्नलिंग की गतिशीलता का बाहरी नियंत्रण प्राप्त किया जाता है10। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत मार्गों की अवधि और कई ऑस्सिलेटरी सिग्नलिंग मार्गों के बीच चरण संबंध को संशोधित करना संभव है। गतिशील सिग्नलिंग रिपोर्टरों के सहवर्ती वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग करते हुए, भेदभाव और सोमाइट गठन पर स्वयं मार्गों पर एनट्रेनमेंट के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सकता है। सिग्नलिंग गतिशीलता पर नियंत्रण के इस स्तर का उपयोग करते हुए, सोमिटोजेनेसिस के दौरान WNT- और Notch-सिग्नलिंग मार्गों के बीच चरण संबंध के महत्व को उजागर किया गया था10।
व्यक्तिगत चिप डिजाइन स्थानीय वातावरण के भीतर spatiotemporal perturbations के लिए विकल्पों की एक बहुतायत के लिए अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए, स्थिर ढाल गठन12,13,14,15, pulsatile सक्रियण / निषेध10,16,17,18 या स्थानीयकृत गड़बड़ी19,20 . माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोगात्मक हैंडलिंग 21,22,23 के स्वचालन के कारण एक अधिक पुनरुत्पादक रीड-आउट और उच्च थ्रूपुट को भी सक्षम कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक्स और ऊतकों के भीतर अंतर्जात सिग्नलिंग दोलनों को हर मानक जीवन विज्ञान प्रयोगशाला में लाने के लिए है। यहां तक कि चिप पीढ़ी के लिए परिष्कृत उपकरणों की अनुपस्थिति में, जैसे कि नरम-लिथोग्राफी के लिए स्वच्छ कमरा और उपकरण, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का निर्माण किया जा सकता है और जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। मोल्ड्स को स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डिज़ाइन किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स की पीढ़ी के लिए एक मोल्ड, जिसमें आमतौर पर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) होता है, को 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित किया जा सकता है, या मुद्रण कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है। इस तरह, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स महंगे उपकरणों की आवश्यकता के बिना एक दिन के भीतर उत्पादित किया जा सकता है24। यहां, एक चिप डिज़ाइन प्रदान किया जाता है, जिसके साथ दो-आयामी (2 डी) पूर्व विवो संस्कृतियों 25 में माउस विभाजन घड़ी के प्रवेश के लिए एक मोल्ड को 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित किया जा सकता है।
ऑन-चिप संस्कृतियों और सटीक गड़बड़ी, माइक्रोफ्लुइडिक्स द्वारा सक्षम, आणविक तंत्र को उजागर करने में उत्कृष्ट क्षमता रखते हैं कि सिग्नलिंग मार्ग बहुकोशिकीय व्यवहार को कैसे नियंत्रित करते हैं। विकास में कई प्रक्रियाओं के लिए सिग्नलिंग गतिशीलता और मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट की आवश्यकता होती है। इससे पहले, प्रयोगशालाओं में माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में सुसंस्कृत कोशिकाएं, ऊतक और पूरे जीव थे और मुख्य रूप से 2 डी सेल संस्कृति के स्पैटिओटेम्पोरल गड़बड़ी के लिए प्रोटोकॉल कहीं और प्रदान किए जाते हैं12,26,27,28,29। बहुकोशिकीय प्रणालियों में स्थानीय वातावरण को संशोधित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स को लागू करने से उच्च-थ्रूपुट और सटीक स्पैटिओटेम्पोरल गड़बड़ी के लिए नए दृष्टिकोण खुलते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक्स का क्षेत्र अब एक बिंदु पर पहुंच गया है कि यह विकासात्मक जीवविज्ञानियों के लिए एक गैर-विशेषज्ञ, सस्ती और आसानी से लागू उपकरण बन गया है।
यहां, एक पायदान सिग्नलिंग अवरोधक की दालों के लिए माउस विभाजन घड़ी के entrainment के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। इस तरह के प्रयोग में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) माइक्रोफ्लुइडिक चिप की पीढ़ी, (2) चिप के टयूबिंग और कोटिंग की तैयारी, और (3) माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग स्वयं (चित्रा 1 ए)। कशेरुक मॉडल प्रणालियों को शामिल करने वाले अनुसंधान के लिए जिम्मेदार समिति से पूर्व नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता होती है।
कैसे सिग्नलिंग गतिशीलता बहुकोशिकीय प्रणालियों को नियंत्रित करती है, क्षेत्र में एक लंबे समय से सवाल रहा है। कार्यात्मक जांच एक महत्वपूर्ण चुनौती है, क्योंकि इन गतिशीलताओं को इस 11 की अनुमति देने के लिए सूक्ष्मरूप से मॉडुलित किया जाना चाहिए। मार्ग गड़बड़ी पर इस तरह के अस्थायी नियंत्रण को सिद्धांत रूप में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो एक उच्च स्थानिक नियंत्रण को भी सक्षम बनाता है34। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स को प्रश्न में प्रत्येक सिग्नलिंग मार्ग के विश्लेषण के लिए परिष्कृत आनुवंशिक उपकरणों की स्थापना की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित वर्तमान प्रोटोकॉल किसी भी सिग्नलिंग मार्ग की गड़बड़ी के लिए एक अत्यधिक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग ऊतक संस्कृतियों में सिग्नलिंग मार्गों की गतिशीलता की कार्यात्मक रूप से जांच करने के लिए अस्थायी रूप से नियंत्रित दवा दालों के आवेदन की अनुमति देता है। यहां, पूर्व विवो संस्कृतियों में सोमिटोजेनेसिस के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल को किसी भी अन्य मॉडल सिस्टम को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में कुछ चरण एक सफल माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं (तालिका 1 में संक्षेप में)। मुख्य बिंदुओं पर निम्नानुसार चर्चा की जाती है। प्रयोग के दौरान मध्यम प्रवाह के कारण, ऊतक संस्कृति कतरनी तनाव का अनुभव करती है। निरंतर प्रवाह के लिए मॉडल प्रणाली के संपर्क में सेल तनाव और चरम मामलों में कर्तन प्रभाव के कारण सेल मृत्यु का कारण बन सकता है। माउस टेलबड्स और वर्तमान चिप डिजाइन की पूर्व विवो ऊतक संस्कृतियों के लिए, 60 μL / h (अधिकतम 100 μL / h) की एक फ्लोरेट को न्यूनतम कर्तन प्रभाव के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए पाया गया था। जब एक ही चिप के लिए एक साथ कई पंप चालू किए जाते हैं, तो कुल प्रवाह दर में वृद्धि का कारण नहीं बनने के लिए व्यक्तिगत पंपों की प्रवाह दर को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है। जब वर्तमान प्रोटोकॉल को अन्य मॉडल सिस्टम और चिप डिज़ाइन के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो प्रवाह दर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, लगातार माध्यम को फ्लश नहीं करना संभव है, लेकिन समय-समय पर चिप 35 पर माध्यम बदलता है। इस तरह के सेटअप को माउस सोमिटोजेनेसिस (अप्रकाशित, डेटा नहीं दिखाया गया है) में सिग्नलिंग दोलनों को नियंत्रित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, एक सेटअप की भी कल्पना की जा सकती है, जिसमें ऊतक संस्कृतियों को प्रत्यक्ष तरल प्रवाह के संपर्क में नहीं लाया जाता है, लेकिन दवाएं पड़ोसी चैनल से प्रसार द्वारा ऊतक तक पहुंचती हैं। इस तरह की प्रणालियों का उपयोग ईएससी भेदभाव 14,36 के इन विट्रो मॉडल में विकास कारकों के ग्रेडिएंट को लागू करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।
माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों का एक प्रमुख मुद्दा प्रयोग के दौरान चिप पर हवा के बुलबुले की घटना है। चिप या टयूबिंग के भीतर हवा के बुलबुले चिप पर समान तरल प्रवाह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और इसके स्थान से भ्रूण संस्कृति को हटाने का कारण बन सकते हैं। हवा के बुलबुले की उपस्थिति को रोकने के लिए, प्रोटोकॉल के विभिन्न चरण अपरिहार्य हैं। सबसे पहले, सिरिंज और माइक्रोफ्लुइडिक चिप के भीतर संस्कृति माध्यम को खुद को एक desiccator (चरण 3.1.3) का उपयोग करके degassed किया जाना चाहिए। दूसरा, लोडिंग इनलेट्स में नमूने लोड करते समय, किसी को सावधान रहना चाहिए कि नमूने (चरण 3.2.3) के साथ चिप में हवा को पाइप न करें। तीसरा, माध्यम के साथ टयूबिंग को भरते समय, चिप (चरण 3.3.2) को संलग्न करने से पहले सभी हवा के बुलबुले को पंप किया जाना चाहिए। अन्यथा, इन बुलबुले को प्रयोग के दौरान मुख्य चिप में धकेल दिया जाएगा। अंत में, प्रयोग के दौरान, माध्यम को अर्ध-पारगम्य टयूबिंग के कारण इमेजिंग चैंबर या इनक्यूबेटर के भीतर संतुलित किया जाता है। टयूबिंग की पारगम्यता भी माध्यम के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देती है, इसलिए सुनिश्चित करें कि टयूबिंग में नए बुलबुले के गठन को रोकने के लिए प्रयोग के दौरान आर्द्रता को विनियमित किया जाता है।
सामान्य तौर पर, माइक्रोफ्लुइडिक्स एक अत्यधिक बहुमुखी उपकरण है जिसे शोधकर्ता के विशिष्ट प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वर्तमान डिजाइन दृष्टिकोण प्रति चिप समानांतर में 12 पूर्व विवो संस्कृतियों तक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। यह संख्या मुख्य रूप से प्रति प्रयोग भ्रूण की संख्या और पर्याप्त संकल्प के साथ प्रत्येक भ्रूण संस्कृति की छवि बनाने में लगने वाले समय से सीमित है। यदि एक ही प्रयोग में कई स्थितियों की तुलना करने की आवश्यकता है, तो एक ही ग्लास स्लाइड पर कई चिप्स लगाए जा सकते हैं। एक चिप डिजाइन प्रदान किया जाता है, जो समानांतर में कई ऊतक स्पष्टीकरणों की इमेजिंग के लिए आदर्श है, लेकिन व्यक्तिगत डिजाइन उच्च थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देने के लिए नमूना संख्या में सीमाओं को दूर कर सकते हैं और एक ही प्रयोग के भीतर अधिक स्थितियों के संयोजन को बढ़ा सकते हैं16,17। माइक्रोफ्लुइडिक्स उन मॉडलों तक सीमित है जिन्हें चिप पर सुसंस्कृत किया जा सकता है और ऑन-चिप संस्कृति को प्रत्येक मॉडल सिस्टम के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करना होगा27,37,38।
पिछले 5-10 वर्षों में, माइक्रोफ्लुइडिक्स को उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण और सिग्नलिंग गतिशीलता और ग्रेडिएंट के सूक्ष्म मॉडुलन के लिए अपनी क्षमता के कारण विभिन्न जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए लागू किया गया है। आजकल, माइक्रोफ्लुइडिक्स एक आसानी से लागू, सस्ता और बहुमुखी उपकरण बन गया है जिसे प्रयोगशालाएं आसानी से स्थापित कर सकती हैं। यहां, वर्तमान प्रोटोकॉल को एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, अर्थात्, सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाली सिग्नलिंग गतिशीलता का अध्ययन करना। ऊतक जीव विज्ञान में व्यक्तिगत अनुसंधान प्रश्नों के अनुरूप इस प्रोटोकॉल और डिजाइन को अनुकूलित करना सीधा है।
The authors have nothing to disclose.
हम यांग ली और जोस मालदा के लिए UMC Utrecht से molds के 3 डी मुद्रण के साथ मदद के लिए आभारी हैं, प्रोटोकॉल पर बहुत उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए Sonnen समूह से करेन वैन डेन Anker, और Tjeerd Faase सूक्ष्मदर्शी के भीतर microfluidic चिप्स के लिए धारक के लिए Hubrecht संस्थान में यांत्रिक कार्यशाला से. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पूरे Sonnen समूह और उनकी रचनात्मक प्रतिक्रिया के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद से एक ईआरसी के तहत वित्त पोषण प्राप्त हुआ, जो केएफएस को अनुदान समझौते नंबर 850554 शुरू कर रहा था।
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |