En protokoll for kultur og manipulering av musens embryonale vev på en mikrofluidisk chip er gitt. Ved å bruke pulser av banemodulatorer, kan dette systemet brukes til å kontrollere signaloscillasjoner eksternt for funksjonell undersøkelse av musens somitogenese.
Periodisk segmentering av presomitisk mesoderm av et utviklende museembryo styres av et nettverk av signalveier. Signalisering av svingninger og graderinger antas å kontrollere henholdsvis tidsberegningen og avstanden mellom segmentdannelse. Mens de involverte signalveiene har blitt studert mye de siste tiårene, har det manglet direkte bevis for funksjonen til å signalisere svingninger i å kontrollere somitogenese. For å muliggjøre funksjonell undersøkelse av signaldynamikk er mikrofluidikk et tidligere etablert verktøy for subtil modulering av disse dynamikkene. Med denne mikrofluidics-baserte entrainment tilnærming endogene signal svingninger synkroniseres av pulser av banen modulatorer. Dette muliggjør modulering av for eksempel svingningsperioden eller faseforholdet mellom to svingende veier. Videre kan romlige gradienter av banemodulatorer etableres langs vevet for å studere hvordan spesifikke endringer i signalgradientene påvirker somitogenese.
Den nåværende protokollen er ment å bidra til å etablere mikrofluidiske tilnærminger for førstegangsbrukere av mikrofluidikk. De grunnleggende prinsippene og utstyret som trengs for å sette opp et mikrofluidisk system er beskrevet, og en brikkedesign er gitt, som en form for brikkegenerering enkelt kan tilberedes ved hjelp av en 3D-skriver. Til slutt, hvordan å dyrke primærmusvev på en mikrofluidisk chip og hvordan man entrain signaliserer svingninger til eksterne pulser av banemodulatorer diskuteres.
Dette mikrofluidiske systemet kan også tilpasses for å huse andre in vivo – og in vitro-modellsystemer som gastruloider og organoider for funksjonell undersøkelse av signaldynamikk og morfin gradienter i andre sammenhenger.
Utviklingen styres av intercellulær kommunikasjon via signalveier. Det er bare et begrenset antall signalveier som orkestrerer den komplekse dannelsen av vev og riktig celledifferensiering i rom og tid. For å regulere denne rekke prosesser kan informasjon kodes i dynamikken i en signalvei, endring av en vei over tid, for eksempel frekvensen eller varigheten av et signal1,2.
Under somitogenese segmenteres somitisk vev periodisk fra presomitisk mesoderm (PSM)3. PSM er romlig organisert av gradienter av Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) og retinoinsyresignalering. I fremre PSM ved bestemmelsesfronten, hvor Wnt- og FGF-signaler er lave, er cellene primet for differensiering til somitter. Differensiering oppstår når en bølge av transkripsjonell aktivering når denne bestemmelsen foran. Innenfor PSM- og Wnt-, FGF- og Notch-signaliseringsoscillaten. Nærliggende celler svinger litt ut av fase, noe som resulterer i bølger av oscillatorisk transkripsjonsaktivering nedstrøms Wnt- og FGF- og Notch-veiene som går fra bakre til fremre PSM. I museembryoer når en transkripsjonsbølge bestemmelsesfronten omtrent hver 2. Å studere somitogenese ved å perturere eller aktivere signalveier kan illustrere viktigheten av disse veiene4,5,6,7,8,9. For å kunne undersøke funksjonen til signaldynamikk i kontroll av cellulær oppførsel, er det imidlertid viktig å subtilt modulere signalveier i stedet for å aktivere eller hemme dem permanent.
For å midlertidig modulere signalveiaktivitet i segmenteringsmusembryoet har Sonnen et al. utviklet et mikrofluidisk system10. Dette systemet tillater tett kontroll av væskestrømmer i mikrokanaler av en brikke som inneholder den biologiske prøven11. For å studere viktigheten av signaldynamikk for riktig segmentering av PSM, brukes dette mikrofluidics-oppsettet til å modulere signaldynamikken til musesegmenteringsklokken ex vivo. Ved sekvensielt pulserende baneaktivatorer eller hemmere inn i kulturkammeret oppnås ekstern kontroll av dynamikken i Wnt, FGF og Notch-signalering10. For eksempel er det mulig å endre perioden for individuelle veier og faseforholdet mellom flere oscillatoriske signalveier. Ved hjelp av samtidig sanntidsavbildning av dynamiske signalreportere kan effekten av entrainment på veiene selv, på differensiering og somittdannelse analyseres. Ved hjelp av dette kontrollnivået over signaldynamikken ble betydningen av faseforholdet mellom Wnt- og Notch-signalveier under somitogenese fremhevet10.
Personlige chipdesign gir mulighet for en mengde alternativer for romlige perturbasjoner i lokalmiljøet, for eksempel stabil gradientformasjon12,13,14,15, pulsatile aktivering / hemming10,16,17,18 eller lokaliserte perturbasjoner19,20 . Mikrofluidikk kan også muliggjøre en mer reproduserbar avlesning og høyere gjennomstrømning på grunn av automatisering av eksperimentell håndtering21,22,23. Den nåværende protokollen er ment å bringe mikrofluidikk og entrainment av endogene signaloscillasjoner i vev til alle standard livsvitenskapslaboratorier. Selv i fravær av sofistikert utstyr for chipgenerering, for eksempel rent rom og utstyr for myk litografi, kan mikrofluidiske sjetonger produseres og brukes til å ta opp biologiske spørsmål. Former kan utformes ved hjelp av fritt tilgjengelig CAD-programvare (computer-aided design). En form for generering av mikrofluidiske sjetonger, vanligvis bestående av polydimetylsiloksan (PDMS), kan skrives ut med en 3D-skriver, eller bestilles fra trykkerier. På denne måten kan mikrofluidiske sjetonger produseres innen en dag uten krav om dyrt utstyr24. Her er det gitt en brikkedesign, som en form for entrainment av musen segmentering klokke i todimensjonale (2D) ex vivo kulturer25 kan skrives ut med en 3D-skriver.
On-chip kulturer og presise perturbasjoner, aktivert av mikrofluidics, har enestående potensial i å avdekke molekylære mekanismer for hvordan signalveier kontrollerer multicellulær oppførsel. Signaldynamikk og morfogen gradienter er nødvendig for mange prosesser i utvikling. Tidligere hadde laboratorier dyrket celler, vev og hele organismer i mikrofluidiske chips og protokoller for romlig perturbasjon av primært 2D-cellekulturen som tilbys andre steder12,26,27,28,29. Bruk av mikrofluidikk for å modulere lokale miljøer i flercellede systemer åpner nye perspektiver for høy gjennomstrømning og presise romlige perturbasjoner. Feltet mikrofluidikk har nå nådd et punkt at det har blitt et ikke-spesialisert, billig og lett anvendelig verktøy for utviklingsbiologer.
Her er det gitt en protokoll for inntreden av musens segmenteringsklokke til pulser av en Notch-signalhemmer. Et slikt eksperiment består av følgende trinn: (1) generasjon mikrofluidisk brikke, (2) fremstilling av rør og belegg av brikken, og (3) selve mikrofluidiske eksperimentet (figur 1A). Forskning som involverer virveldyrmodellsystemer krever forhåndsetisk godkjenning fra ansvarlig komité.
Hvordan signaldynamikk kontrollerer multicellulære systemer har vært et langvarig spørsmål i feltet. Funksjonell undersøkelse utgjør en viktig utfordring, fordi disse dynamikkene må moduleres subtilt for å tillate dette11. Slik tidsmessig kontroll over baneperturbasjoner kan i prinsippet oppnås med optogenetikk, noe som også muliggjør en høy romlig kontroll34. Imidlertid krever optogenetikk etablering av sofistikerte genetiske verktøy for analyse av hver signalvei det gjelder. Den nåværende protokollen som er beskrevet her, gir et svært allsidig verktøy for perturbasjon av enhver signalvei. Mikrofluidics-eksperimentet gjør det mulig å bruke temporally kontrollerte legemiddelpulser for å undersøke dynamikken i signalveier i vevskulturer. Her er fokuset på studiet av somitogenese i ex vivo-kulturer , men protokollen kan tilpasses alle andre modellsystemer.
Enkelte trinn i protokollen er avgjørende for å utføre et vellykket mikrofluidikkeksperiment (oppsummert i tabell 1). Sentrale punkter diskuteres som følger. På grunn av middels strømning i løpet av eksperimentet opplever vevskulturen skjærspenning. Eksponering av modellsystemet for kontinuerlig strømning kan forårsake cellestress og i ekstreme tilfeller celledød på grunn av skjæreeffekt. For eksvivovevskulturer av musehalsbud og den nåværende chipdesignen ble det funnet en strømningshastighet på 60 μL / t (maksimalt 100 μL / t) for å fungere godt med minimal skjæreeffekt. Når flere pumper slås på samtidig for samme spon, må strømningshastigheten til individuelle pumper justeres tilsvarende for ikke å forårsake en økning i den totale strømningshastigheten. Når den nåværende protokollen er tilpasset andre modellsystemer og brikkedesign, bør strømningshastigheten optimaliseres. Alternativt er det mulig å ikke skylle medium kontinuerlig, men periodisk endre medium på chip35. Et slikt oppsett kan også brukes til å kontrollere signalisering av svingninger i musens somitogenese (upublisert, data ikke vist). Videre kan et oppsett også forestilles, der vevskulturer ikke blir utsatt for direkte væskestrøm, men legemidler når vevet ved diffusjon fra en nærliggende kanal. Slike systemer har blitt brukt med hell for å bruke gradienter av vekstfaktorer til in vitro-modeller av ESC-differensiering14,36.
Et stort problem med mikrofluidiske eksperimenter er forekomsten av luftbobler på chip under eksperimentet. Luftbobler i brikken eller slangen kan forstyrre jevn væskestrøm på brikken og kan føre til fjerning av embryokulturen fra plasseringen. For å forhindre tilstedeværelse av luftbobler, er ulike trinn i protokollen uunnværlige. For det første må kulturmediet i sprøyter og selve mikrofluidisk brikke avgasses ved hjelp av en tørkemiddel (trinn 3.1.3). For det andre, når man laster prøver inn i lasteinntakene, må man være forsiktig så man ikke rører luft inn i brikken sammen med prøven (trinn 3.2.3). For det tredje, når du fyller slangen med medium, må alle luftbobler pumpes ut før du fester brikken (trinn 3.3.2). Ellers vil disse boblene bli presset inn i hovedbrikken under eksperimentet. Til slutt, under eksperimentet, er mediet likevektet i bildekammeret eller inkubatoren på grunn av den halvgjennomtrengelige slangen. Permeabiliteten til slangen gir også mulighet for fordampning av mediet, så sørg for at fuktigheten reguleres under eksperimentet for å forhindre dannelse av nye bobler i slangen.
Generelt er mikrofluidikk et svært allsidig verktøy som kan tilpasses forskerens spesifikke spørsmål. Den nåværende designtilnærmingen gjør det mulig å forestille seg opptil 12 ex vivo-kulturer parallelt per brikke. Dette tallet er hovedsakelig begrenset av antall embryoer per eksperiment og tiden det tar å avbilde hver embryokultur med tilstrekkelig oppløsning. Hvis flere forhold må sammenlignes i et enkelt eksperiment, kan flere sjetonger monteres på et enkelt glasssklie. En chip design er gitt, som er ideell for avbildning av flere vev explants parallelt, men personlige design kan overvinne begrensninger i prøvenummer for å tillate høy gjennomstrømning analyse og øke kombinasjonen av flere forhold innenfor et enkelt eksperiment16,17. Mikrofluidikk er begrenset til modeller som kan dyrkes på en chip og on-chip kultur må optimaliseres for hvert modellsystem individuelt27,37,38.
I løpet av de siste 5-10 årene har mikrofluidikk blitt brukt til å løse ulike biologiske spørsmål på grunn av potensialet for tilnærminger med høy gjennomstrømning og subtile moduler av signaldynamikk og gradienter. I dag har mikrofluidikk blitt et lett anvendelig, billig og allsidig verktøy som laboratorier enkelt kan etablere. Her er den nåværende protokollen optimalisert for et bestemt program, nemlig å studere signaldynamikk som styrer somitogenese. Det er enkelt å tilpasse denne protokollen og designen slik at den passer til individuelle forskningsspørsmål i vevsbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Yang Li og Jos Malda fra UMC Utrecht for hjelp med 3D-utskrift av mugg, Karen van den Anker fra Sonnen-gruppen for svært nyttige tilbakemeldinger på protokollen, og Tjeerd Faase fra det mekaniske verkstedet ved Hubrecht Institute for innehaveren for mikrofluidiske chips i mikroskopet. Vi vil takke hele Sonnen-gruppen for kritisk lesning av manuskriptet og anmelderne for deres konstruktive tilbakemeldinger. Dette arbeidet fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet under en ERC-startavtale nr. 850554 til K.F.S.
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |