यहां हम एक पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण के साथ संयुक्त पूर्व वीवो मानव त्वचा का उपयोग कर घाव की मरंमत का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित तकनीक प्रदर्शित करता है । यह पद्धति संभावित घाव उपचारों के मूल्यांकन के लिए एक पूर्व-नैदानिक मंच प्रदान करती है।
क्रोनिक गैर-उपचार घाव, जो मुख्य रूप से बुजुर्गों और मधुमेह को प्रभावित करते हैं, नैदानिक अपूरित आवश्यकता का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र हैं। दुर्भाग्य से, वर्तमान पुराने घाव उपचार अपर्याप्त हैं, जबकि उपलब्ध पूर्व नैदानिक मॉडल खराब नए उपचारों की नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करते हैं। यहां हम मानव त्वचा की मरम्मत प्रतिक्रिया के कई पहलुओं का आकलन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट, प्री-क्लीनिकल मॉडल का वर्णन करते हैं। आंशिक मोटाई घाव मानव पूर्व वीवो त्वचा में बनाए गए थे और एक उपचार समय पाठ्यक्रम में सुसंस्कृत थे। त्वचा घाव बायोप्सी पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया के लिए फिक्सेटिव में एकत्र किए गए थे। फिक्स्ड नमूनों को अवरुद्ध किया गया था और प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसमें फ्लोरोसेंटली संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के माध्यम से प्राप्त पता लगाया गया था। प्रत्येक बायोप्सी में प्रतिशत घाव बंद होने (पुनः-एपीथेलिलाइजेशन) की गणना करने से पहले घावों को जवाबी दाग दिया गया था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को लागू करने, हमें पता चलता है कि स्वस्थ दाता त्वचा में बनाए गए 2 मिमी एक्ससिओनल घावों को 4-5 के बाद घायल होने के बाद पूरी तरह से फिर से एपिथेलाइज्ड किया जाता है। इसके विपरीत, मधुमेह त्वचा के घावों की बंद करने की दर काफी कम हो जाती है, बेफिक्र बाधा सुधार के साथ। मानव त्वचा को एक उपन्यास पूरे-माउंट धुंधला दृष्टिकोण के साथ घायल करने के संयोजन से पूर्व वीवो घाव की मरम्मत की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेजी से और प्रजनन योग्य विधि की अनुमति देता है। सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल संभावित घाव उपचारों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने, पूर्व-नैदानिक परीक्षण और सत्यापन को बदलने के लिए एक मूल्यवान मानव मंच प्रदान करता है।
क्रोनिक, गैर-उपचार घाव, जो बुजुर्गों और मधुमेह में अत्यधिक प्रचलित हैं, नैदानिक अपूरित आवश्यकता का एक प्रमुख रूप से सराहना क्षेत्र हैं। ये घाव रोगियों के लिए एक बड़ा शारीरिक और मनोवैज्ञानिक बोझ प्रस्तुत करते हैं और 1 के इलाज के लिए हर साल स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं को अरबों खर्चकरतेहैं । घाव जीव विज्ञान और प्रौद्योगिकी में प्रगति की बेहतर समझ के बावजूद, पुराने घावों का 40% तक अभी भी सबसे अच्छा मानक देखभाल2के बाद ठीक करने में विफल रहता है। इस प्रकार, मधुमेह पैर अल्सर के साथ रोगियों के 14-26% बाद में विच्छेदन3की आवश्यकता होती है, जबकि 5 साल के बाद विच्छेदन मृत्यु दर लगभग 70%4पर खड़ा है। नतीजतन, खराब चिकित्सा घावों द्वारा लगाए गए पर्याप्त स्वास्थ्य देखभाल बोझ को कम करते हुए जीवन की रोगी की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए प्रभावोत्पादक नए उपचार विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। खराब भविष्य कहनेवाला पूर्व नैदानिक मॉडल प्रभावी नए उपचारों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बने हुए हैं।
घाव की मरम्मत एक गतिशील और बहुमुखी प्रक्रिया है जिसमें सेल प्रकारों की विविध श्रृंखला, संचार के अनगिनत स्तर और एक ऊतक वातावरण शामिल है जिसे अस्थायी रूप से फिर से तैयार किया गया है। त्वचा उपचार चार प्रमुख रिपारेटिव चरणों पर टिकी है: हेमोसेसिस, सूजन, प्रसार और मैट्रिक्स रीमॉडलिंग। ये चरण अंततः रक्त हानि और संक्रमण को रोकने के लिए कार्य करते हैं, घाव की सतह (एक प्रक्रिया को फिर से एपिथेलिलाइजेशन कहा जाता है) को बंद कर देते हैं और त्वचा को एक अघायल राज्य5में वापस कर देते हैं। पुराने घाव विविध एटियोलॉजी और उपचार प्रक्रियाओं के लिए व्यापक क्षोभ के साथ जुड़े रहे हैं6,आगे चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान उलझी हुई है । फिर भी, घाव विकृति के आणविक और सेलुलर ड्राइवरों को स्पष्ट करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोण7का परीक्षण करने के लिए मॉडलों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित की गई है।
सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला घाव मरम्मत मॉडल माउस में तीव्र घायल है। चूहे मशीनी अध्ययन के लिए अत्यधिक पथिक होते हैं और वृद्धावस्था औरमधुमेहके मान्य मॉडल प्रदान करते हैं । माउस और मानव चिकित्सा के बीच दिखाई गई सामान्य समानताओं के बावजूद, त्वचा संरचना और उपचार गतिशीलता में प्रजातियों के बीच अंतर रहते हैं। इसका मतलब यह है कि अधिकांश मुरीन घाव अनुसंधान आसानी से क्लिनिक9में अनुवाद नहीं करता है। नतीजतन, उच्च प्रयोज्यता और अनुवादशीलता10, 11के साथ मानव इन विट्रो और पूर्व वीवो प्रणालियों की ओर एक धक्का दिया गया है ।
यहां हम पूर्व वीवो मानव त्वचा में आंशिक मोटाई उत्तेजना घावों के प्रदर्शन के लिए एक गहन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम पूर्व वीवो मानव त्वचा उपचार का मूल्यांकन करने की एक अत्यधिक प्रजनन विधि के रूप में हमारे पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण को भी रेखांकित करते हैं। हम एपिडर्मल रिपेयर (री-एपिथेलिलाइजेशन) और बाद में बाधा गठन के प्रक्षेपवक्र को दिखाते हैं, जो स्वस्थ बनाम मधुमेह मानव त्वचा में घाव बंद होने की दर का मूल्यांकन करते हैं। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि चिकित्सा प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए एंटीबॉडी की एक श्रृंखला के साथ उपयोग के लिए पूरे माउंट धुंधला कैसे अनुकूलित किया जा सकता है।
इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, हम पूरे माउंट ऊतक धुंधला का उपयोग कर मानव पूर्व वीवो त्वचा में घाव बंद करने का मूल्यांकन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। यह संभावित घाव उपचार के महत्वपूर्ण मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए और मानव घाव की मरम्मत प्रतिक्रिया की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन है। हमने पूर्व वीवो त्वचा घावों में उपचार मूल्यांकन पहले12,13प्रकाशित किया है, फिर भी इन रिपोर्टों में घाव बंद करने को मापने के लिए पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग नहीं किया गया था। पूरे माउंट धुंधला अभी तक आसान है और मानक हिस्टोलॉजी की तुलना में कम तकनीकी अनुभव की आवश्यकता है, जिसमें पैराफिन या OCT एम्बेडिंग और नमूनों की अनुभागिंग शामिल है। पूरे माउंट प्रक्रिया भी प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है, पूरे घाव की मात्रा की अनुमति और ऊतक के भीतर एक परिभाषित स्थिति में सिर्फ एक भी ट्रांसवर्स अनुभाग नहीं (तुलनात्मक चित्रण के लिए चित्रा 4B देखें) । हम पूरी तरह से पूरे गैर सममित घाव संरचना के उपचार की मात्रा के महत्व का समर्थन करते हैं, जैसा कि स्पष्ट रूप से रिया और डनवाल्ड द्वारा मुरीन तीव्र घावों के लिए रेखांकित किया गया है14। इन लेखकों ने घाव आकृति विज्ञान के प्रजनन योग्य और सटीक माप के लिए वीवो एक्सिसिओनल घावों में क्रमिक रूप से खंडित होने के महत्व को दिखाया। धारावाहिक खंड समान रूप से मानव पूर्व वीवो घावों पर लागू किया जा सकता है; हालांकि, घाव बंद होने और पुनः-एपीथिलाइजेशन के सटीक मात्राकरण के लिए, उच्च थ्रूपुट पूरे-माउंट धुंधला पसंदीदा तरीका होना चाहिए। हम ध्यान दें कि इस पूरे माउंट धुंधला प्रोटोकॉल भी पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए बाद के प्रसंस्करण (मोम या OCT) के साथ संगत होना चाहिए ।
पूरे माउंट धुंधला नुकसान के बिना नहीं है । हालांकि यह घाव उपचार प्रयोगों में उच्च प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, यह मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों की तुलना में विश्लेषण के लिए और अधिक ऊतक के उपयोग की आवश्यकता है । यह एक ऐसा मुद्दा हो सकता है जहां ऊतक का उपयोग सीमित है, विशेष रूप से जहां कई एंटीबॉडी का आकलन करने की आवश्यकता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक चीरा घाव विधि को नियोजित करना होगा जहां घाव की चौड़ाई अपेक्षाकृत समान हो और परिवर्तनशीलता कम हो (जैसा कि माउस और मानव घावों में दिखाया गया है15,16)। हालांकि, एक्सिसिओनल घाव अधिकांश रोगीय घाव प्रकारों पर अधिक लागू रहते हैं17।
इस अध्ययन में, 6 मिमी त्वचा के विस्तार के केंद्र के भीतर 2 मिमी आंशिक मोटाई घाव बनाए गए थे। इस विधि को वैकल्पिक उत्तेजना घाव और विभिन्न त्वचा की गहराई18पर एक्सप्लांट आकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, घाव उत्पन्न करने के लिए आवश्यक बल दाताओं के बीच भिन्न होगा, जहां वृद्ध त्वचा को बायोप्सी के लिए कम बल की आवश्यकता होगी। हम प्रमुख खिंचाव के निशान या अन्य संरचनात्मक परिवर्तन प्रदर्शित करने वाली त्वचा का उपयोग करने से भी बचेंगे। हमने पूर्व वीवो हीलिंग प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर विचार करने के लिए एंटीबॉडी की एक श्रृंखला को मान्य किया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य त्वचा-प्रासंगिक एंटीबॉडी के साथ भी किया जा सकता है, जहां एंटीबॉडी सांद्रता और इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। फिर भी, हमारा मानना है कि हमारा प्रोटोकॉल कुल घाव बंद होने के पूर्ण मात्राकरण के लिए सबसे उपयुक्त है, जिसके बाद ब्याज के विशिष्ट प्रोटीन का स्थानिक आकलन किया जाता है । जबकि पूरे माउंट ऊतक वर्गों के मानक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण बनाम इम्यूनोलोकलाइजेशन का कम संकल्प प्रदान करता है, यह अतिरिक्त 3डी जानकारी प्रदान करता है जो मानक 2डी हिस्टोलॉजी से गायब है।
वीवो मॉडल में बनाम पूर्व वीवो त्वचा में उपचार का आकलन करने की एक चेतावनी यह है कि इसमें प्रणालीगत प्रतिक्रिया का अभाव है। घाव की मरम्मत का एक महत्वपूर्ण पहलू सूजन और बाद में ऊतक दाने है, जो वक्यूलेचर19से भड़काऊ कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं की आमद के कारण होता है। इस सीमा के बावजूद, पूर्व वीवो त्वचा अभी भी सेल-आधारित घाव परख की तुलना में नैदानिक उपचार का बेहतर पुनर्पूंजीकरण प्रदान करती है। सामान्य रूप से इन विट्रो प्रयोगों में ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर उगाए जाने वाले एकल सेल प्रकार मोनोलेयर या सह-संस्कृतियों को शामिल किया जाता है, जबकि पूर्व वीवो त्वचा सेल व्यवहार का पता लगाने के लिए एक देशी वातावरण प्रदान करती है। हाल ही में, त्वचा के समकक्ष प्रणालियों की एक संख्या उभरी है, जहां त्वचा कृत्रिम मैट्रिक्स और अलग त्वचा कोशिकाओं20, 21से एक प्रयोगशाला सेटिंग में उगायाजाताहै । हालांकि ये मॉडल मानव त्वचा की नकल सबसे इन विट्रो दृष्टिकोण से बेहतर है, वे अभी भी पूरी तरह से देशी ऊतक पर्यावरण अनुकरण नहीं करते हैं और आम तौर पर पुन: उत्पन्न करने के लिए बहुत नाजुक होते हैं। इसके अतिरिक्त, हम (और अन्य लोगों ने) यह प्रदर्शित किया है कि पूर्व वीवो मानव त्वचा ऊतक निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बरकरार रखता है, जिसमें कोई संदेह नहीं है कि22,23की मरम्मत में योगदान मिलेगा। भविष्य के काम में अब देर से चरण चिकित्सा मूल्यांकन24के लिए पूर्व वीवो मॉडल की व्यवहार्यता और इम्यूनोसक्षमता का विस्तार करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए । एक विकल्प आशाजनक अंग-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों की और उन्नति है जो ऊतक व्यवहार्यता को लंबा करने और संस्कृति25में दो सप्ताह तक देशी त्वचा वास्तुकला को बनाए रखने में सक्षम हैं। पूर्व वीवो मॉडल ने भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जैसे न्यूट्रोफिल, को मेजबान ऊतक26 में सफलतापूर्वक शामिल करके त्वचा की भड़काऊ प्रतिक्रिया के महत्व पर विचार करना शुरू कर दिया है या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया27को प्रकाश में लाने के लिए एंटीबॉडी के साथ मेजबान ऊतक इंजेक्शन। हम उम्मीद करते हैं कि इन निष्कर्षों से भविष्य में और अधिक परिष्कृत और अनुवादयोग्य तरीकों के विकास का मार्ग प्रशस्त होगा ।
घाव बंद करने को मापने के लिए पूर्व वीवो त्वचा का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ स्वस्थ (जैसे, गैर-मधुमेह) बनाम रोग (जैसे, मधुमेह या वृद्ध) ऊतक में उपचार दरों की तुलना करने की क्षमता है। यहां हमने दिखाया कि फिर से epithelialization और बाधा गठन वास्तव में स्वस्थ पूर्व वीवो घावों बनाम मधुमेह में बिगड़ा हुआ है । दरअसल, यह रोग की मरम्मत के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक मार्ग प्रदान करता है, जहां पुराने घावों के विकास के लिए वृद्धावस्था और मधुमेह प्रमुख जोखिम कारक हैं1। जबकि इन विट्रो पैथोलॉजिकल मॉडल मौजूद हैं, जैसे वृद्ध और मधुमेह ऊतक से अलग कोशिकाएं, या हाइपरग्लाइसेमिया28, 29की नकल करने के लिए उच्च ग्लूकोज में सुसंस्कृत कोशिकाएं, ये कोशिकाएं एक बार वीवो माइक्रोएनवायरमेंट से हटाए जाने के बाद अपने फेनोटाइप को जल्दी से खो सकती हैं। बाह्य रोग चिकित्सा वातावरण का एक महत्वपूर्ण घटक डर्मल मैट्रिक्स है, जो बुढ़ापे और मधुमेह दोनों में बदल जाता है30। दरअसल, यह बेफिक्र मैट्रिक्स निवासी और भोले फाइब्रोब्लास्ट31,32के व्यवहार को प्रभावित करता है। इस प्रकार, उनके मेजबान ऊतक वातावरण में कोशिकाओं का अध्ययन करने के महत्व को कम करके आंका नहीं जा सकता है।
संक्षेप में, हमारा प्रोटोकॉल मानव घाव को फिर से एपिथेलाइजेशन की मात्रा निर्धारित करने, नियामक कारकों का पता लगाने और संभावित चिकित्सीय12, 13की वैधता और प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक महत्वपूर्ण मंच प्रदान करता है। जबकि पूर्व नैदानिक परीक्षण अभी भी वीवो दृष्टिकोण में आवश्यकता होती है, पूर्व वीवो मानव ऊतक का उपयोग करके एक संयुक्त रणनीति और वीवो मुरीन घायल में पूर्व-नैदानिक मार्ग को परिष्कृत करना चाहिए, जबकि क्रॉस-प्रजातियों की अनुवादशीलता में वृद्धि करते हुए पशु उपयोग को कम करना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम रोगी ऊतक प्रदान करने के लिए श्री पाओलो Matteuci और श्री जॉर्ज स्मिथ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी ऊतक संग्रह और प्रयोगशाला सुविधाएं प्रदान करने के लिए डेज़ी अपील के साथ सहायता के लिए मिस एंबर गुलाब Stafford के आभारी हैं ।
50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1×2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |