JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Genknackning av CRISPR/Cas9 och cellsortering i makrofag och T-cellinjer

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Detta protokoll använder fluorescerande reportrar och cellsortering för att förenkla inknöjande experiment i makrofag och T-cellinjer. Två plasmider används för dessa förenklade knock-in experiment, nämligen en CRISPR/Cas9- och DsRed2-uttrycker plasmid och en homolog rekombination donatorplasmid uttrycker EBFP2, som är permanent integrerad vid Rosa26 locus i immunceller.

Abstract

Funktionella genomikstudier av immunsystemet kräver genetiska manipuleringar som innebär både radering av målgener och tillsats av element till proteiner av intresse. Identifiering av genfunktioner i cellinjemodeller är viktigt för genupptäckt och utforskning av cell inneboende mekanismer. Genetiska manipuleringar av immunceller som T-celler och makrofagcelllinjer med CRISPR/Cas9-medierad knock-in är dock svåra på grund av den låga transfectioneffektiviteten hos dessa celler, särskilt i ett quiescent tillstånd. För att modifiera gener i immunceller används läkemedelsresistensval och virusvektorer vanligtvis för att berika för celler som uttrycker CRIPSR / Cas9-systemet, vilket oundvikligen resulterar i oönskade ingrepp av cellerna. I en tidigare studie designade vi dubbla fluorescerande reportrar kopplade till CRISPR/Cas9 som övergående uttrycktes efter elektroporation. Denna tekniska lösning leder till snabb genborttagning i immunceller; Genknackning i immunceller som T-celler och makrofager utan användning av läkemedelsresistensval eller virusvektorer är dock ännu mer utmanande. I den här artikeln visar vi att genom att använda cellsortering för att underlätta val av celler som övergående uttrycker CRISPR / Cas9-konstruktioner riktade mot Rosa26-locus i kombination med en donatorplasmid, kan genknackning uppnås i både T-celler och makrofager utan läkemedelsresistensberikning. Som ett exempel visar vi hur man uttrycker mänskliga ACE2, en receptor av SARS-Cov-2, som är ansvarig för den nuvarande Covid-19-pandemin, i RAW264.7 makrofager genom att utföra knock-in experiment. Sådana genknackning celler kan användas i stor utsträckning för mekanistiska studier.

Introduction

Immunceller är kritiska för försvar mot patogener. Både medfödd och adaptiv immunitet krävs för clearance av infektionsmedel och underhåll av vävnad homeostas1,2. Cellinjemodeller är viktiga verktyg för att förstå de molekylära grunderna i däggdjurens immunsystem; De används i funktionella in vitro-analyser, såsom modellering av aktivering av mänskliga T-celler, och för att bestämma funktionen hos genetiska faktorer för att aktivera eller dämpa immunsvar3,4. Det är viktigt att notera att däggdjurens immunsystem är enormt heterogent och, lika viktigt, ett stort antal molekyler kontrollerar differentiering, migration och funktion hos en viss cell typ5,6.

Grupperade regelbundet interrymda korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktyg möjliggör genetisk manipulering av specifika celltyper, vilket underlättar funktionell anteckning av gener på ett exakt sätt7,8. Flera publicerade protokoll har beskrivit leveransen av CRISPR/ Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplex som kallas ribonukleoproteiner (RNPs) i HEK293-celler, Jurkat-cellinjer, primäraT-celler 9,10, makrofager11,12,13, stamceller14och andra15,16. I dessa protokoll uppnås genmärkning vanligtvis genom att en fluorescerande tagg smälts till endogenaproteiner 17,18. Men få försök har gjorts att använda dubbla fluorescerande reportrar, som är kompatibla med enkelcellssortering, för att underlätta knock-in experiment19,20, särskilt i immunceller.

Djupgående mekanistiska analyser som syftar till att förstå funktionerna hos en ny genetisk faktor i immunceller kräver i allmänhet cellliknande specifik radering av en gen, genetiska räddningsexperiment och helst identifiering av dess interagerare. Även om metoder för optimering av genetisk borttagning av gener i immunceller har publicerats9,15,21, har mycket färre metoder rapporterats för att införa knock-in alleler med mångsidiga funktioner för att förstå immunsvaret. Därför, i detta protokoll syftar vi till att beskriva i detalj ett effektivt och mycket reproducerbart protokoll för att uttrycka ett protein av intresse (POI) vid safe harbor locus Rosa26 i både mänskliga och murin immun cellinjer. Vi designade ett tvåfärgs reportersystem för att berika för celler transfekterade med plasmider som uttrycker CRISPR / Cas9 (DsRed2) och en rekombinant DNA-mall (EBFP2), som kan isoleras genom cellsortering. Efter detta protokoll fick vi flera knock-in linjer av den mänskliga T cellinjen Jurkat och murin makrofag RAW264.7 för funktionella analyser av dåligt studerade proteiner.

Som ett exempel visar vi i detta protokoll hur man får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrycker mänskliga ACE2 (en receptor av SARS-Cov-2)22. Eftersom medfödda immunceller är involverade i patogenesen vid Covid-1923,24 ochhuman ACE2 betraktas som en viktig receptor som krävs för viralt inträde i celler före replikering, makrofager med knock-in av mänskliga ACE2 kan fungera som ett användbart verktyg för mekanistiska studier av viral multiplikation inuti makrofager. Parallellt presenterar vi också ett exempel på knock-in av en gen vid den mänskliga ROSA26 locus för att uttrycka RASGRP1 proteinet, som smältes vid dess amino ändstation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler är viktiga målceller i immunterapier, och ett ökande antal studier har fokuserat på manipulation av deras lyhördhet för cancer25,26. Eftersom Rasgrp1 är känt för att vara en viktig signalmolekyl nedströms T-cellsreceptorn och dess interagerare inte är välklarlagd 27, ger OST-RASGRP1-in-modellen grunden för att identifiera interactorer som reglerar T-cells svar på tumörer och infektion. Sammantaget kan dessa verktyg användas för Covid-19-studier och upptäckt av nya molekyler som interagerar med Rasgrp1.

Protocol

1. Design och Plasmid konstruktion av sgRNAs som riktar sig till Rosa26 Locus Designguide RNAs runt önskad insättningsplats Se till att införingsplatsen för musen Rosa26 (nedan kallad mRosa26)inknårsexperiment finns i mRosa26:s förstaintron. denna webbplats har använts i tidigare studier28,29. För inknämningsförsök i mänskliga celler, se till att införingsplatse…

Representative Results

Efter protokollet som beskrivs ovan för att utföra knock-in experiment på mRosa26 locus med hjälp av murin RAW264.7 makrofager, utformade vi en inriktning vektor för att uttrycka mänskliga ACE2, en receptor för SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Med en liknande design genererade vi mänskliga Jurkat T-celler med knock-in av det OST-märkta RASGRP1 fusionsproteinet (Figur 2C). Efter transfection av tre plasmider, varav två användes för uttryck av CRI…

Discussion

I våra experiment visade vi hur man utför knock-in redigering i immunceller från konstruktionsdesign till knock-in cell screening och validering med mänskliga Jurkat T-celler och murin RAW264.7 makrofager som exempel. Både T-cells- och makrofatcelllinjer är resistenta mot transfekt36,37; Problemet med låg effektivitet med CRISPR / Cas9-leverans kan dock övervinnas med hjälp av fluorescerande reportrar i kombination med cellsortering. Detta protokoll är …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar flöde cytometri kärnanläggningen vid Xinxiang Medical University. Utvecklingen av sådan teknik har fått stöd av NSFC-81601360 LZ, 81471595 och 32070898 till YL. Arbetet stöds också av Foundation of Henan Educational Committee nr 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting
check_url/it/62328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image