La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le metastasi sono una delle principali cause di morte per cancro. Nonostante i miglioramenti nelle strategie di trattamento, il cancro metastatico ha una prognosi sfavorevole. Ci troviamo quindi di fronte a un urgente bisogno di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo delle metastasi e quindi di proporre trattamenti efficaci per il cancro avanzato. I tumori metastatici sono difficili da trattare, poiché le biopsie sono invasive e inaccessibili. Recentemente, c'è stato un notevole interesse per le biopsie liquide che includono sia l'acido desossiribonucleico circolante privo di cellule (DNA) che le cellule tumorali circolanti dal sangue periferico e abbiamo stabilito diverse linee cellulari tumorali circolanti da pazienti con carcinoma colorettale metastatico per partecipare alla loro caratterizzazione. Infatti, per caratterizzare funzionalmente queste cellule rare e mal descritte, il passo cruciale è quello di espanderle. Una volta stabilite, le linee di cellule tumorali circolanti (CTC) possono quindi essere coltivate in condizioni di sospensione o aderenza. A livello molecolare, le linee CTC possono essere ulteriormente utilizzate per valutare l'espressione di specifici marcatori di interesse (come il differenziamento, le cellule staminali epiteliali o tumorali) mediante immunofluorescenza o analisi citometrica. Inoltre, le linee CTC possono essere utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci alle chemioterapie gold standard e alle terapie mirate. La capacità delle linee CTC di avviare i tumori può anche essere testata mediante iniezione sottocutanea di CTC in topi immunodeficienti.
Infine, è possibile testare il ruolo di specifici geni di interesse che potrebbero essere coinvolti nella disseminazione del cancro modificando i geni CTC, l'acido ribonucleico a forcina corta (shRNA) o Crispr/Cas9. Le CTC modificate possono quindi essere iniettate in milze di topo immunodeficienti, per imitare sperimentalmente parte del processo di sviluppo metastatico in vivo.
In conclusione, le linee CTC sono uno strumento prezioso per la ricerca futura e per la medicina personalizzata, dove permetteranno di prevedere l'efficienza del trattamento utilizzando proprio le cellule originariamente responsabili delle metastasi.
Introduzione
Nonostante i recenti miglioramenti nella diagnosi precoce del cancro e nella strategia terapeutica, oltre il novanta per cento della morbilità del cancro è ancora dovuto alle metastasi1. Il processo metastatico è una cascata a più fasi che inizia con il distacco locale delle cellule dal tumore primario e il loro ingresso nel flusso sanguigno dove diventano cellule tumorali circolanti (CTC) per colonizzare infine siti distanti come fegato e polmoni, nel caso del cancro del colon-retto (CRC)2. Recentemente, c'è stata una crescente attenzione alle biopsie liquide, che sono uno strumento non invasivo per rilevare ed enumerar....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i protocolli in vivo sono stati approvati dalle agenzie etiche animali.
1. Amplificazione CTC in condizioni di coltura 3D
- Per coltivare CTC in sospensione, prima CTC di seme in pozzetti di una piastra ultra-low attachment (ULA) a 24 pozzetti alla concentrazione massima di 5 cellule / μL e in 1 mL di mezzo M12 (cioè DMEM-F12 avanzato integrato con 2 mM l-glutammina, 100 unità / mL di penicillina e streptomicina, supplemento N2, fattore di crescita epidermico 20 ng / mL e fattore di crescita fibroblasti 10 ng / mL10).
- Per consentire la formazione della sfera e l'espansione cel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Entrambe le espressioni EpCAM e CD26 osservate rispettivamente da IF (Figura 1A pannello di destra) e FACS ( Figura1B) indicano che la linea CTC è epiteliale e mostrano uno dei segni distintivi CSC10. Questo tratto epiteliale può essere ulteriormente caratterizzato dalla colorazione con anticorpi diretti contro altri marcatori epiteliali e mesenchimali. In tal modo, potrebbe essere possibile sapere approssimativamente dov.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo sopra descritto è stato utilizzato inizialmente per la caratterizzazione funzionale del CTC del colon-retto, ma può essere utilizzato per altri tipi di cancro come il cancro al seno e può essere adattato per modelli murini.
Il vero fattore limitante è il numero di CTC presenti nel campione di sangue e l'efficienza della tecnica utilizzata per isolarle ed espanderle. Sono state descritte diverse tecniche di isolamento CTC basate su specifiche proprietà CTC come il Parsortix, un di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.
Ringraziamenti
Questo progetto di ricerca nel laboratorio Pannequin è stato sostenuto da una borsa di ricerca del SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Le tesi di dottorato di Guillaume Belthier e Zeinab Homayed sono state sostenute dalla lega anti-cancro / Ligue contre le Cancer. Lo stipendio di Céline Bouclier è stato finanziato dalla "regione Occitania". Grazie a Julian Venables per l'editing in inglese.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare luminescente | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice a membrana basale | Corning | 354230 | |
| Costar 24 pozzetti Trasparente Fondo piatto Attacco ultra-basso Multiplo Piastre a pozzetti, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2 di prima qualità, | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutammina (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | ||
| Penicillina-Streptomicina (5.000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
