जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मुराइन इंटरस्केपुलर ब्राउन एडीपोज ऊतक से ब्राउन एडिपोसाइट्स को अलग करना
Summary
यह अध्ययन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मुराइन ब्राउन एडिपोसाइट्स को अलग करने की एक नई विधि का वर्णन करता है।
Abstract
ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) स्तनधारियों में गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार है, और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) बीएटी की कार्यात्मक इकाइयां हैं। बीए में मल्टीलोकुलर लिपिड बूंदें और प्रचुर मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया दोनों होते हैं, और वे अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) व्यक्त करते हैं। बीए को उनकी उत्पत्ति के आधार पर दो उप-प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है: भ्रूण व्युत्पन्न शास्त्रीय बीए (सीबीए) और सफेद एडिपोसाइट्स व्युत्पन्न बीए। उनके अपेक्षाकृत कम घनत्व के कारण, बीए को पारंपरिक सेंट्रीफ्यूजेशन विधि के साथ बीएटी से अलग नहीं किया जा सकता है। इस अध्ययन में, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए चूहों से बीए को अलग करने के लिए एक नई विधि विकसित की गई थी। इस प्रोटोकॉल में, वयस्क चूहों से इंटरस्केपुलर बीएटी को कोलेजनेज और डिस्पेस समाधान के साथ पचाया गया था, और अलग किए गए बीए को 6% आयोडिक्सानोल समाधान से समृद्ध किया गया था। आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ अलगाव के लिए पृथक बीए को ट्राइज़ोल अभिकर्मक के साथ मिलाया गया था। आरएनए अलगाव के बाद, लाइसेट के कार्बनिक चरण का उपयोग प्रोटीन निष्कर्षण के लिए किया गया था। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि 6% आयोडिक्सानोल समाधान ने अनुवर्ती जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययनों में हस्तक्षेप किए बिना बीए को कुशलतापूर्वक समृद्ध किया। प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ) एक विकास कारक है जो मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विकास और प्रसार को नियंत्रित करता है। भूरे रंग के वसा ऊतक की तुलना में, पृथक बीए में पीडीजीएफए की काफी अधिक अभिव्यक्ति थी। सारांश में, यह नई विधि एकल सेल-प्रकार के स्तर पर भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करती है।
Introduction
चूहों और मनुष्यों दोनों में दो प्रकार के वसा ऊतक होते हैं: सफेद वसा ऊतक (डब्ल्यूएटी) और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी)1। डब्ल्यूएटी सफेद एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में ऊर्जा संग्रहीत करता है, और बीएटी के भूरे रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) गर्मी2 के रूप में रासायनिक ऊर्जा को नष्ट करते हैं। उनके विकास की उत्पत्ति के आधार पर, बीए को आगे शास्त्रीय बीए (सीबीए) में वर्गीकृत किया जाता है जो भ्रूण के विकास के दौरान बनता है और सफेद एडिपोसाइट्स व्युत्पन्न बीए (बेज / ब्राइट कोशिकाएं, तनाव की स्थिति में सफेद एडिपोसाइट्स से परिवर्तित)3। बीए मल्टीलोकुलर हैं और थर्मोजेनिक प्रोटीन अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1)4 को व्यक्त करते हैं। इंटरस्केपुलर बैट (आईबीएटी) डिपो छोटे स्तनधारियों5 में प्राथमिक सीबीए डिपो में से एक है, जबकि बेज कोशिकाएं डब्ल्यूएटी6 के भीतर फैली हुई हैं।
ऊर्जा को कम करने की उनकी प्रकृति के कारण, बीए को मोटापे को कम करने के लिए चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में बहुत ध्यान दियागया है। मोटापे के इलाज के उद्देश्य से बीए का फायदा उठाने के लिए, आणविक तंत्र को समझना आवश्यक है जो बीए फ़ंक्शन, अस्तित्व और भर्ती को नियंत्रित करता है। बीएटी और डब्ल्यूएटी सहित वसा ऊतक विषम हैं। एडिपोसाइट्स को छोड़कर, वसा ऊतकों में कई अन्य सेल प्रकार होते हैं, जैसे एंडोथेलियल कोशिकाएं, मेसेनकाइमल स्टेम सेल और मैक्रोफेज8। यद्यपि चूहों बीए में विशेष रूप से उम्मीदवार जीन को कम करने के लिए आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं, जैसे कि यूसीपी 1:: क्रे लाइन9, बीएटी या डब्ल्यूएटी से बीए को शुद्ध करने की तकनीक सीमित है, जिससे एकल-कोशिका प्रकार के स्तर पर बीए का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। इसके अतिरिक्त, शुद्ध बीए प्राप्त किए बिना, बीए और गैर-बीए के बीच संबंध स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं होंगे। उदाहरण के लिए, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआर) का उपयोग अविभाजित मेसेनकाइमल कोशिकाओं के लिए मार्कर के रूप में किया गया है, और यह बीएटी के एंडोथेलियल और अंतरालीय कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। ठंडे तनावग्रस्त बीएटी में, पीडीजीएफआर सकारात्मक पूर्वज कोशिकाएं नए बीए10 को जन्म देती हैं। पीडीजीएफआर को इसके लिगैंड पीडीजीएफ द्वारा सक्रिय किया जाता है, एक विकास कारक जो मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विकास और प्रसार को नियंत्रित करताहै 11; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि बीए पीडीजीएफ को स्रावित करके पीडीजीएफआर सकारात्मक पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित करते हैं या नहीं।
हाल ही में, एक बीए अलगाव प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है, जो प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 12 पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल में, 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान का उपयोग बीए को गैर-बीए से अलग करने के लिए किया गया था, और समृद्ध बीए को एफएसीएस द्वारा और शुद्ध किया गया था। इस प्रोटोकॉल का आवेदन एफएसीएस प्रक्रिया की आवश्यकता से सीमित है, जो उपकरण और एफएसीएस ऑपरेशन अनुभवों दोनों पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, बीएटी से बीए को अलग करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए बीए का उपयोग सीधे जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन के आंकड़ों से पता चलता है कि बीए एक प्रमुख पीडीजीएफ संसाधन हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए बीए को अलग करने की एक नई विधि विकसित की गई थी।
एक प्रकाशित बीए अलगाव प्रोटोकॉल में, बीए12 को समृद्ध करने के लिए 3% बीएसए समाधान क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेड लिन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ एचएल 138454-01 और मेसोनिक मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट फंड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
Riferimenti
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