유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리
Summary
이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.
Abstract
갈색 지방 조직 (BAT)은 포유류에서 떨리지 않는 열 발생을 담당하며 갈색 지방 세포 (BA)는 BAT의 기능 단위입니다. BA는 다안 지질 방울과 풍부한 미토콘드리아를 모두 포함하며 결합 해제 단백질 1 (UCP1)을 발현합니다. BA는 기원에 따라 배아 유래 고전 BA(cBA)와 백색 지방 세포 유래 BA의 두 가지 하위 유형으로 분류됩니다. 상대적으로 밀도가 낮기 때문에 BA는 전통적인 원심분리 방법으로 BAT에서 분리할 수 없습니다. 이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 마우스에서 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서, 성인 마우스로부터의 interscapular BAT를 Collagenase 및 Dispase 용액으로 분해하고, 해리 된 BA를 6 % 요오 딕산 올 용액으로 풍부하게했다. 그런 다음 분리된 BA를 트리졸 시약으로 용해시켜 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리했습니다. RNA 분리 후, 용해물의 유기상을 단백질 추출에 사용하였다. 우리의 데이터는 6% 요오드 딕산올 용액이 후속 유전자 및 단백질 발현 연구를 방해하지 않으면서 BA를 효율적으로 농축한다는 것을 보여주었습니다. 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)는 중간 엽 세포의 성장과 증식을 조절하는 성장 인자입니다. 갈색 지방 조직과 비교하여 분리 된 BA는 Pdgfa의 발현이 상당히 높았습니다. 요약하면,이 새로운 방법은 단일 세포 유형 수준에서 갈색 지방 세포의 생물학을 연구하기위한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
생쥐와 인간 모두 백색 지방 조직(WAT)과 갈색 지방 조직(BAT)의 두 가지 유형의 지방 조직을 가지고 있습니다.1. WAT는 백색 지방 세포에 트리글리세리드 형태로 에너지를 저장하고 BAT의 갈색 지방 세포 (BA)는 화학 에너지를 열2로 발산합니다. 발달 기원에 따라 BA는 배아 발달 중에 형성된 고전 BA(cBA)와 백색 지방세포 유래 BA(베이지/브라이트 세포, 스트레스 조건에서 백색 지방세포에서 전환)3로 더 분류됩니다. BA는 다안선이며 열 발생 단백질 결합 해제 단백질 1 (UCP1)4을 발현합니다. 견갑간 BAT (iBAT) 저장소는 작은 포유류5의 1 차 cBA 저장소 중 하나 인 반면, 베이지 색 세포는 WAT6 내에 분산되어 있습니다.
BA는 에너지를 발산하는 특성으로 인해 비만을 줄이기 위한 치료 표적으로 많은 주목을 받고 있습니다7. 비만 치료 목적으로 BA를 이용하려면 BA 기능, 생존 및 모집을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. BAT 및 WAT를 포함한 지방 조직은 이질적입니다. 지방 세포를 제외하고, 지방 조직은 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 및 대식세포와 같은 많은 다른 세포 유형을 함유한다8. UCP1::Cre line9와 같이 마우스 BA에서 후보 유전자를 특이적으로 고갈시키는 유전 도구를 사용할 수 있지만 BAT 또는 WAT에서 BA를 정제하는 기술은 제한적이어서 단일 세포 유형 수준에서 BA를 연구하기가 어렵습니다. 또한 순수 BA를 취득하지 않으면 BA와 비 BA 간의 관계가 명확하게 설명되지 않습니다. 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)는 미분화 중간 엽 세포의 마커로 사용되어 왔으며 BAT의 내피 및 간질 세포에서 발현됩니다. 저온 스트레스 BAT에서, PDGFRα 양성 전구 세포는 새로운 BAs10을 생성한다. PDGFRα는 그의 리간드 PDGF에 의해 활성화되고, 중간엽 세포의 성장 및 증식을 조절하는 성장 인자11; 그러나, BA가 PDGF를 분비함으로써 PDGFRα 양성 전구 세포의 행동에 영향을 미치는지는 불분명하다.
최근에는 형광 활성화 세포 분류(FACS)12를 기반으로 하는 BA 분리 프로토콜이 발표되었습니다. 이 프로토콜에서, 3% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 사용하여 BA를 비-BA로부터 분리하고, 농축된 BA를 FACS에 의해 추가로 정제하였다. 이 프로토콜의 적용은 장비 및 FACS 운영 경험에 모두 의존하는 FACS 프로세스의 요구 사항에 의해 제한됩니다. 이 연구에서는 BAT에서 BA를 분리하기 위한 새로운 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 BA는 유전자 및 단백질 발현 연구에 직접 사용할 수 있습니다. 또한이 연구의 데이터는 BA가 주요 PDGF 자원임을 시사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다.
공개된 BA 격리 프로토콜에서, 3% BSA 용액은 BAs12를 풍부하게 하기 위해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 이 공개된 프로토콜에 의해 달성된 농축 BA는 단백질 발현 분석에 직접 사용될 수 없었다. 이는 BAs 용액에 존재하는 농축된 BSA가 후속 단백질 추출을 방해하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin은 National Institutes of Health HL138454-01 및 Masonic Medical Research Institute 기금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
Riferimenti
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