मुराइन हार्ट्स में ऑप्टोजेनेटिक मल्टी-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन लागू करके उन्नत कार्डियक रिदम प्रबंधन
Summary
यह काम ट्रांसजेनिक चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) चूहों के बरकरार मुराइन दिलों की हृदय ताल को नियंत्रित करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट करता है, जो माइक्रो-एलईडी सरणी के साथ स्थानीय फोटोस्टिम्यूलेशन और एपिकार्डियल झिल्ली क्षमता के एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग का उपयोग करता है।
Abstract
वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण है। उच्च ऊर्जा वाले बिजली के झटके का उपयोग करके विद्युत डिफिब्रिलेशन वर्तमान में जीवन-धमकी देने वाले वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन के लिए एकमात्र उपचार है। हालांकि, डिफिब्रिलेशन के दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जिसमें असहनीय दर्द, ऊतक क्षति और रोग का बिगड़ना शामिल है, जो अधिक कोमल हृदय ताल प्रबंधन रणनीतियों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सा आवश्यकता का संकेत देता है। ऊर्जा को कम करने वाले विद्युत दृष्टिकोण के अलावा, कार्डियक ऑप्टोजेनेटिक्स को प्रकाश-संवेदनशील झिल्ली आयन चैनलों और प्रकाश दालों का उपयोग करके हृदय गतिविधि को प्रभावित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में पेश किया गया था। वर्तमान अध्ययन में, लैंगेंडॉर्फ के सफल फोटोस्टिम्यूलेशन के लिए एक मजबूत और वैध विधि का वर्णन मल्टी-साइट पेसिंग के आधार पर किया जाएगा, जो माइक्रो लाइट-एमिटिंग डायोड (माइक्रो-एलईडी) की 3 x 3 सरणी को लागू करता है। एपिकार्डियल झिल्ली वोल्टेज तरंगों का एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण क्षेत्र-विशिष्ट उत्तेजना के प्रभावों की जांच की अनुमति देता है और सीधे साइट पर नई प्रेरित हृदय गतिविधि का मूल्यांकन करता है। प्राप्त परिणाम बताते हैं कि डिफिब्रिलेशन की प्रभावकारिता कार्डियक अतालता के दौरान फोटोस्टिम्यूलेशन के लिए चुने गए मापदंडों पर दृढ़ता से निर्भर है। यह प्रदर्शित किया जाएगा कि हृदय का रोशन क्षेत्र समाप्ति की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और साथ ही अतालता पैटर्न को संशोधित करने के लिए रोशनी के दौरान हृदय गतिविधि का लक्षित नियंत्रण कैसे प्राप्त किया जा सकता है। सारांश में, यह तकनीक कार्डियक ताल के वास्तविक समय प्रतिक्रिया नियंत्रण के रास्ते पर ऑन-साइट तंत्र हेरफेर को अनुकूलित करने की संभावना प्रदान करती है और, क्षेत्र विशिष्टता के बारे में, गैर-विशिष्ट विद्युत सदमे अनुप्रयोगों के उपयोग की तुलना में हृदय प्रणाली को संभावित नुकसान को कम करने में नए दृष्टिकोण।
Introduction
अतालता के दौरान स्थानिक-अस्थायी गतिशीलता की प्रारंभिक जांच से पता चला है कि कार्डियक फाइब्रिलेशन के दौरान जटिल विद्युत पैटर्न भंवर जैसी घूर्णनउत्तेजना तरंगों द्वारा संचालित होते हैं। इस खोज ने अतालता के अंतर्निहित तंत्र में नई अंतर्दृष्टि दी, जिसके कारण मायोकार्डियम 2,3,4 के बहु-साइट उत्तेजना के आधार पर नए विद्युत समाप्ति उपचारों का विकास हुआ। हालांकि, विद्युत क्षेत्र उत्तेजना का उपयोग करने वाले उपचार गैर-स्थानीय हैं और मांसपेशियों के ऊतकों सहित आसपास की सभी उत्तेजक कोशिकाओं को आंतरिक कर सकते हैं, जिससे सेलुलर और ऊतक क्षति, साथ ही असहनीय दर्द भी हो सकता है। विद्युत चिकित्सा के विपरीत, ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ कार्डियोमायोसाइट एक्शन पोटेंशिअल को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट और ऊतक-सुरक्षात्मक तकनीक प्रदान करते हैं। इसलिए, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना में कार्डियक फाइब्रिलेशन के दौरान अराजक सक्रियण पैटर्न के न्यूनतम आक्रामक नियंत्रण की क्षमता है।
आनुवंशिक हेरफेर 5,6,7 के माध्यम से उत्तेजक कोशिकाओं में प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल रोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) की शुरूआत ने फोटोस्टिम्यूलेशन का उपयोग करके उत्तेजक कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता के विध्रुवण को सक्षम किया। न्यूरोनल नेटवर्क के सक्रियण, हृदय गतिविधि का नियंत्रण, दृष्टि और सुनवाई की बहाली, रीढ़ की हड्डी की चोटों का उपचार, और अन्य 8,9,10,11,12,13,14 सहित कई चिकित्सा अनुप्रयोग विकसित किए गए हैं। कार्डियोलॉजी में सीएचआर 2 के आवेदन में इसके मिलीसेकंड प्रतिक्रिया समय15 के कारण महत्वपूर्ण क्षमता है, जिससे यह लयबद्ध हृदय गतिशीलता के लक्षित नियंत्रण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
इस अध्ययन में, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के बरकरार दिलों के बहु-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन को दिखाया गया है। संक्षेप में, एक ट्रांसजेनिक अल्फा-एमएचसी-सीएचआर 2 माउस लाइन यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम एफपी 7/2007-2013 (हेल्थ-एफ 2-2009-241526) के दायरे में स्थापित की गई थी और कृपया प्रोफेसर एस ई लेहनार्ट द्वारा प्रदान की गई थी। सामान्य तौर पर, ट्रांसजेनिक वयस्क पुरुष C57/B6/J, अल्फा-एमएचसी के नियंत्रण में क्रे-रिकोम्बिनेस को व्यक्त करते हुए मादा B6.Cg-जीटी (ROSA)26Sortm27.1 (CAG-COP4* H134R/tdTomato) Hye/J के साथ संभोग करने के लिए जोड़ा गया था। चूंकि कार्डियक स्टॉप कैसेट को दूसरी पीढ़ी में हटा दिया गया था, इसलिए संतान ने एक स्थिर एमएचसी-सीएचआर 2 अभिव्यक्ति दिखाई और इसका उपयोग कार्डियक फोटोसेंसिटिव कॉलोनियों को बनाए रखने के लिए किया गया था। सभी प्रयोग 36 – 48 सप्ताह की उम्र में दोनों लिंगों के वयस्क चूहों के साथ किए गए थे। रोशनी को 3 x 3 माइक्रो-एलईडी सरणी का उपयोग करके हासिल किया जाता है, जैसा कि16,17 में वर्णित है, सिवाय इसके कि सिलिकॉन-आधारित आवास और लघु ऑप्टिकल ग्लास फाइबर लागू नहीं किए जाते हैं। कार्डियक एप्लिकेशन में इसका पहला उपयोग18 में पाया जाता है। एक समान निर्माण तकनीक पर आधारित एक रैखिक माइक्रो-एलईडी सरणी को हार्ट पेसिंग19 के लिए एक मर्मज्ञ जांच के रूप में लागू किया गया है। माइक्रो-एलईडी को 550 μm की पिच पर 3 x 3 सरणी में व्यवस्थित किया जाता है, जो एक बहुत छोटे क्षेत्र पर एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और उच्च चमकदार शक्ति दोनों प्रदान करता है। लेखक इस काम में एक बहुमुखी स्थानीय बहु-साइट फोटोस्टिम्यूलेशन प्रदर्शित करते हैं जो उपन्यास एंटी-लयबद्ध चिकित्सा विधियों को विकसित करने के लिए मार्ग खोल सकता है।
निम्नलिखित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में एक प्रतिगामी लैंगनडॉर्फ छिड़काव एक्स विवो शामिल है, जिसके लिए कैनुलेटेड महाधमनी छिड़काव इनलेट के रूप में कार्य करती है। लागू छिड़काव दबाव और हृदय संकुचन के कारण परफ्यूसेट कोरोनरी धमनियों के माध्यम से बह रहा है, जो महाधमनी से शाखा करता है। प्रस्तुत कार्य में, हृदय को 73.2 मिमीएचजी के बराबर, परफ्यूसेट जलाशयों को 1 मीटर ऊंचाई तक बढ़ाकर प्राप्त निरंतर दबाव सेटअप का उपयोग करके संक्रमित किया जाता है, जो 2.633 ± 0.583 एमएल / मिनट की प्रवाह दर तक उपज देता है। प्रयोग के दौरान दो प्रकार के टायरोड के समाधान का उपयोग परफ्यूसेट के रूप में किया जाता है। नियमित टायरोड का समाधान एक स्थिर साइनस ताल का समर्थन करता है, जबकि लो-के + टायरोड के समाधान को पिनासिडिल के साथ मिलाया जाता है ताकि मुराइन दिल में अतालता के प्रेरण को सक्षम किया जा सके। हेक्सागोनल पानी के स्नान का उपयोग छह अलग-अलग प्लानर खिड़कियों के माध्यम से हृदय के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे अपवर्तन द्वारा कम विकृति के साथ कई ऑप्टिकल घटकों के युग्मन की अनुमति मिलती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्डियक टैचीरिथमिया का एक सफल उपचार कार्डियक थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, अतालता दीक्षा, स्थायीकरण और समाप्ति के अंतर्निहित बायोफिज़िकल तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं। इसलिए, कार्ड…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्रयोगों के दौरान अपने उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए मैरियन कुंजे और टीना अल्थॉस को धन्यवाद देना चाहते हैं। परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम एफपी 7/2007-2013 से अनुदान समझौता संख्या हेल्थ-एफ 2-2009-241526 के तहत धन प्राप्त हुआ है। जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च, डीजेडएचके ईवी (प्रोजेक्ट एमडी 28), पार्टनर साइट गोएटिंगेन, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन सीआरसी 1002 (प्रोजेक्ट सी 03), और मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा भी सहायता प्रदान की गई थी। यह काम आंशिक रूप से ब्रेनलिंक्स-ब्रेनटूल्स, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, अनुदान संख्या ईएक्ससी 1086) द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता के क्लस्टर द्वारा समर्थित था।
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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