Avansert hjerterytmehåndtering ved å bruke optogenetisk multi-site fotostimulering i murine hjerter
Summary
Dette arbeidet rapporterer en metode for å kontrollere hjerterytmen til intakte murinhjerter av transgene kanalrhodopsin-2 (ChR2) mus ved hjelp av lokal fotostimulering med en mikro-LED-matrise og samtidig optisk kartlegging av epikardial membranpotensial.
Abstract
Ventrikulære takyarytmier er en viktig årsak til dødelighet og sykelighet over hele verden. Elektrisk defibrillering ved hjelp av høy-energi elektriske støt er for tiden den eneste behandlingen for livstruende ventrikkelflimmer. Defibrillering kan imidlertid ha bivirkninger, inkludert uutholdelig smerte, vevskader og forverring av prognosen, noe som indikerer et betydelig medisinsk behov for utvikling av mer milde styringsstrategier for hjerterytme. I tillegg til energireduserende elektriske tilnærminger ble hjerteoptogenetikk introdusert som et kraftig verktøy for å påvirke hjerteaktiviteten ved hjelp av lysfølsomme membranionkanaler og lyspulser. I denne studien vil en robust og gyldig metode for vellykket fotostimulering av Langendorff-perfunderte intakte murinehjerter bli beskrevet basert på multi-site pacing ved å bruke en 3 x 3 array av mikrolysdioder (mikro-LED). Samtidig optisk kartlegging av epikardiale membranspenningsbølger gjør det mulig å undersøke effekten av regionspesifikk stimulering og evaluerer den nylig induserte hjerteaktiviteten direkte på stedet. De oppnådde resultatene viser at effekten av defibrillering er sterkt avhengig av parametrene som er valgt for fotostimulering under hjertearytmi. Det vil bli demonstrert at det opplyste området av hjertet spiller en avgjørende rolle for termineringssuksess, samt hvordan målrettet kontroll av hjerteaktivitet under belysning for å endre arytmimønstre kan oppnås. Oppsummert gir denne teknikken en mulighet til å optimalisere manipuleringen på stedet på vei til sanntids tilbakemeldingskontroll av hjerterytmen og, med hensyn til regionspesifisiteten, nye tilnærminger for å redusere potensiell skade på hjertesystemet sammenlignet med bruken av ikke-spesifikke elektriske støtapplikasjoner.
Introduction
Tidlige undersøkelser av romlig-temporal dynamikk under arytmi viste at de komplekse elektriske mønstrene under hjerteflimmer drives av virvellignende roterende eksitasjonsbølger1. Dette funnet ga ny innsikt i de underliggende mekanismene for arytmier, som deretter førte til utvikling av nye elektriske termineringsbehandlinger basert på multi-site eksitasjon av myokardiet 2,3,4. Imidlertid er behandlinger som bruker elektrisk feltstimulering ikke-lokale og kan innervere alle omkringliggende spennende celler, inkludert muskelvev, forårsaker cellulær og vevskader, samt utålelig smerte. I motsetning til elektriske terapier gir optogenetiske tilnærminger en spesifikk og vevbeskyttende teknikk for å fremkalle kardiomyocyttvirkningspotensialer med høy romlig og tidsmessig presisjon. Optogenetisk stimulering har derfor potensial for minimal invasiv kontroll av de kaotiske aktiveringsmønstrene under hjerteflimmer.
Innføringen av den lysfølsomme ionkanalen channelrhodopsin-2 (ChR2) i spennende celler via genetisk manipulasjon 5,6,7, muliggjorde depolarisering av membranpotensialet til spennende celler ved hjelp av fotostimulering. Flere medisinske applikasjoner, inkludert aktivering av nevrale nettverk, kontroll av hjerteaktivitet, restaurering av syn og hørsel, behandling av ryggmargsskader og andre 8,9,10,11,12,13,14 er utviklet. Anvendelsen av ChR2 i kardiologi har betydelig potensial på grunn av sin millisekund responstid15, noe som gjør den godt egnet for målrettet kontroll av arytmisk hjertedynamikk.
I denne studien vises multi-site fotostimulering av intakte hjerter av en transgen musemodell. Oppsummert ble en transgen alfa-MHC-ChR2-muselinje etablert innenfor rammen av Det europeiske fellesskaps syvende rammeprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) og vennlig levert av prof. S. E. Lehnart. Generelt ble transgen voksen hann C57/B6/J, som uttrykker Cre-recombinase under kontroll av alfa-MHC, paret for å parre seg med kvinnelig B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Siden hjerte-STOP-kassetten ble slettet i andre generasjon, viste avkommet et stabilt MHC-ChR2-uttrykk og ble brukt til å opprettholde hjerte-lysfølsomme kolonier. Alle eksperimenter ble gjort med voksne mus av begge kjønn i en alder av 36-48 uker. Belysningen oppnås ved hjelp av en 3 x 3 mikro-LED-array, produsert som beskrevet i16,17, bortsett fra at det silisiumbaserte huset og de korte optiske glassfibrene ikke er implementert. Den første bruken i en hjerteapplikasjon er funnet i18. En lineær mikro-LED-matrise basert på en lignende fabrikasjonsteknologi har blitt brukt som en penetrerende sonde for hjertetempo19. Mikro-lysdiodene er arrangert i en 3 x 3 array i en tonehøyde på 550 μm, noe som gir både en høy romlig oppløsning og en høy stråleeffekt på et svært lite område. Forfatterne demonstrerer i dette arbeidet en allsidig lokal multi-site fotostimulering som kan åpne veien for å utvikle nye antiarytmiske terapimetoder.
Følgende eksperimentelle protokoll innebærer en retrograd Langendorff perfusjon ex vivo, for hvilken kanylert aorta fungerer som perfusjonsinnløp. På grunn av det påførte perfusjonstrykket og hjertekontraksjonen strømmer perfusatet gjennom koronararteriene, som forgrener seg fra aorta. I det presenterte arbeidet blir hjertet perfundert ved hjelp av et konstant trykkoppsett oppnådd ved å heve perfusatreservoarene til 1 m høyde, tilsvarende 73,2 mmHg, noe som gir en strømningshastighet på 2,633 ± 0,583 ml / min. To typer Tyrodes løsning brukes som perfusat under forsøket. Vanlig Tyrodes løsning støtter en stabil sinusrytme, mens Low-K + Tyrodes løsning blandes med Pinacidil for å muliggjøre induksjon av arytmi i murine hjerter. Bruken av et sekskantet vannbad tillater observasjon av hjertet gjennom seks forskjellige plane vinduer, noe som gjør det mulig å koble flere optiske komponenter med mindre forvrengning ved brytning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En vellykket behandling av hjertetakyarytmier er nøkkelen til hjertebehandling. Imidlertid er de biofysiske mekanismene som ligger til grunn for arytmiinitiering, fortsettelse og avslutning ikke fullt ut forstått. Derfor har hjerteforskning som mål å optimalisere elektrisk sjokkterapi mot en mer skånsom avslutning av arytmier, og dermed øke livskvaliteten til pasienter 28,29,30,31. Lav en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Marion Kunze og Tina Althaus for deres utmerkede tekniske støtte under eksperimenter. Forskningen som fører til resultatene har mottatt finansiering fra EUs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 under tilskuddsavtale nummer HEALTH-F2-2009-241526. Støtte ble også gitt av det tyske senteret for kardiovaskulær forskning, DZHK eV (Project MD28), partnerstedet Goettingen, den tyske forskningsstiftelsen CRC 1002 (prosjekt C03) og Max Planck Society. Dette arbeidet ble delvis støttet av BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansiert av den tyske forskningsstiftelsen (DFG, tilskuddsnummer EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Riferimenti
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
