Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi
Summary
Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.
Abstract
Karaciğer yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve Amerika Birleşik Devletleri’nde kronik karaciğer hastalığından ölüm oranı keskin bir şekilde artmaktadır. Sağlıklı karaciğerler toksik hasardan yenilenebilir, ancak ileri karaciğer hastalığında karaciğerin doğal yenilenme yeteneği bozulur. Zebra balığı, yenilenmeyi incelemek için güçlü bir deneysel sistem olarak ortaya çıkmıştır. Karaciğerin bir kısmının cerrahi olarak çıkarıldığı, geri kalanının sağlam bıraktığı doğrudan klinik alaka düzeyine sahip bir prosedür olan kısmi hepatektomiden karaciğer yenilenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Kısmi hepatektomi için standart bir protokol yoktur; bu modeli kullanan önceki çalışmalar biraz farklı protokoller kullanmış ve farklı sonuçlar bildirmiştir. Burada açıklanan, yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi yapmak için verimli, tekrarlanabilir bir protokoldür. Zebra balıklarının resected lobun epimorfik rejenerasyonunu yapabildiğini göstermek için bu tekniği kullanıyoruz. Bu protokol zebra balıklarında karaciğer yenilenmesi için gerekli mekanizmaları daha fazla sorgulamak için kullanılabilir.
Introduction
İnsanlardaki katı organlar arasında karaciğer yenilenebilen tek organdır1. Karaciğer, temel metabolik fonksiyonlardan, enerji depolamadan, kan detoksifikasyonundan, plazma proteinlerinin salgılanmasından ve safra üretiminden sorumlu temel bir organ olduğu için bu kritiktir2. Toksik veya enflamatuar hasar nedeniyle kaybedilen hepatositler öncelikle kalan hepatositlerin bölünmesi ile değiştirilir1. Karaciğer yenilenmesini incelemek için klasik deneysel modellerden biri, karaciğerin bireysel loblarının çıkarıldığı ve kalan lobların sağlam kaldığı kısmi hepatektomidir3. Bu prosedür başlangıçta karaciğer kütlesinin yaklaşık üçte ikisinin çıkarıldığı sıçanlarda geliştirilmiştir. Memelilerde kısmi hepatektomiden sonra, karaciğer ilk kütlesini geri alana kadar kalan loblarda telafi edici rejenerasyon meydana gelir. Özellikle, memeli karaciğeri eksik lobların yerini almaz.
Zebra balığı (Danio rerio) yetişkin organ rejenerasyonunu incelemek için çekişli bir modeli temsil eder4. Zebra balığı karaciğeri, yapısal olarak memeli karaciğerinden farklı olsa da, aynı hücre türlerinden oluşur ve memelilerde olduğu gibi aynı işleve hizmet eder2. İki sırt lob ve bağırsak boyunca düzleştirilmiş tek bir ventral lob ile üç lobdan oluşur. Kısmi hepatektomi daha önce zebra balıklarında, kesin rejenerasyon modu ile çelişen hesaplarla gerçeklenmiştir. Tipik olarak, tüm ventral lobun çıkarılmasıyla üçte bir kısmi hepatektomi yapılır. İlk raporlar, ventral lobun çıkarılmasından sonra,5, 6,7hafta içinde tamamen yenilendiğini vememelikaraciğerinin aksine zebra balığı karaciğerinin epimorfik rejenerasyon yapabileceğini göstermektedir. Daha sonraki çalışmalar, ventral lobun çıkarılmasının, eksik ventral lobun yenilenmesi yerine sırt loblarında telafi edici yenilenme ile sonuçlendiğini ve sonuçta karaciğer kütlesinin bir hafta içinde iyileşmesine neden olduğunu göstermiştir8,9. Ventral lobun rezeksiyonunu takiben sırt loblarının transkriptomik profillemesi, kompanzasyon rejenerasyonu ile ilişkili önemli değişiklikler ortaya koydu10. Karaciğer rejenerasyon modunun yaralanmanın boyutuna göre değişebileceği göz önüne alındığında8, sonuçlardaki tutarsızlıkların araştırma grupları arasındaki kısmi hepatektomi protokolündeki teknik varyasyondan kaynaklanabileceğini tahmin ettik.
Bu protokol, ventral lobun çıkarılmasıyla yetişkin zebra balıklarında üçte bir kısmi hepatektomi yapılması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu teknik karaciğer yenilenme mekanizmalarının değerlendirilmesi için değerli olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karaciğer yenilenmesi için zebra balığı ve memeli modelleri arasındaki anatomik farklılıklar karaciğer rezeksiyonu için benzersiz zorluklar ortaya koyuyor. Zebra balıklarındaki karaciğer kalbe ve bağırsaya yakındır; yanlışlıkla her iki organa da zarar vermek mortalitenin artmasına neden olur. Zebra balığı karaciğeri kapsüllenmemiştir, bu da bağırsaktan ayrılmasını zorlaştırır. Karaciğer, portal damarlardan bağırsaktan besin bakımından zengin kan alır. Memelilerde, bağırsaktan ay…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. NIAAA (F32AA027135) tarafından desteklenir. W.G., R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 ve Claudia Adams Barr Kanser Araştırmalarında Mükemmellik Programı tarafından desteklenmektedir. W.G. Biyomedikal Bilimler alanında bir Pew Bursiyeridir.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Riferimenti
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologia dello sviluppo. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
