Vi præsenterer en protokol for lameller forberedelse af springet frosne biologiske prøver af kryo-fokuserede ion stråle mikromaskiner til høj opløsning strukturelle undersøgelser af makromolekyler in situ med cryo-elektron tomografi. Den fremlagte protokol indeholder retningslinjer for udarbejdelse af lameller af høj kvalitet med høj reproducerbarhed til strukturel karakterisering af makromolekyler inde i Saccharomyces cerevisiae.
I dag er kryo-elektrontomografi (cryo-ET) den eneste teknik, der kan give næsten atomare opløsning strukturelle data om makromolektlære komplekser in situ. På grund af den stærke interaktion mellem en elektron og sagen er højopløselige cryo-ET-undersøgelser begrænset til prøver med en tykkelse på mindre end 200 nm, hvilket begrænser anvendeligheden af cryo-ET kun til de perifere områder af en celle. En kompleks arbejdsgang, der omfatter udarbejdelse af tynde cellulære tværsnit ved kryofokuseret ionstrålemikromaskiner (cryo-FIBM), blev introduceret i løbet af det sidste årti for at muliggøre erhvervelse af cryo-ET-data fra det indre af større celler. Vi præsenterer en protokol til fremstilling af cellulære lameller fra en prøve vitrified ved dyk frysning udnytte Saccharomyces cerevisiae som et prototypisk eksempel på en eukaryote celle med bred udnyttelse i cellulære og molekylær biologi forskning. Vi beskriver protokoller for vitrificering af S. cerevisiae i isolerede pletter af nogle få celler eller en kontinuerlig monolag af cellerne på et TEM-gitter og giver en protokol for lameller forberedelse ved cryo-FIB for disse to prøver.
Den seneste teknologiske og software udvikling har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) af vitrified biologiske prøver en af de vigtigste teknikker i strukturel biologi forskning i det sidste årti1,2. Præparatet af en prøve til kryo-EM består normalt af påføring af et renset protein eller et proteinkompleks med nukleinsyre på prøvebæreren (TEM-gitter), efterfulgt af fjernelse af det meste af væsken med et filterpapir og dykfrysning af gitteret med det resterende tynde lag af en prøve i flydende ethan eller propan3 . Prøven er således fastgjort i et tyndt lag (typisk <80 nm) af amorf buffer i en fuldt hydreret tilstand, ved næsten indfødte forhold og uden behov for kemisk fiksering eller tungmetalkontrast. Billeddannelse af den strukturelt homogene prøve i transmissionselektronmikroskopet resulterer derefter i data, der kan bruges til bestemmelse af makromolekylets tredimensionelle struktur ved næsten atomopløsning ved hjælp af en enkelt partikelanalyseprotokol2. En sådan in vitro-struktur svarer til repræsentationen af makromolekylet under de betingelser og behandling, der anvendes under prøveforberedelse. Selv om de strukturer, der bestemmes under in vitro-forholdene, normalt svarer til makromolekylets fuldt funktionelle tilstand, ville evnen til at afbilde rumlige relationer mellem forskellige makromolekyler inde i cellen give en yderligere funktionel sammenhæng til de strukturelle data.
Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) bruges til at rekonstruere 3D-mængder af pleomorfe objekter eller makromolekyllære komplekser in situ4,5. Fordelen ved cryo-ET er, at de tredimensionelle oplysninger opnås ved billeddannelse af en enkelt enhed. Den opløsning, hvor individuelle makromolekylære komplekser eller organeller observeres, er imidlertid meget begrænset. Derfor er det nødvendigt med et gennemsnit af makromolekylerne (subtomogram gennemsnit, STA) med samme struktur fra et større antal tomogram for at nå 4-8 Å-opløsningsmodeller fra cryo-ET-dataene6,7. Det har for nylig vist sig, at cryo-ET og STA også kan anvendes til at bestemme høj opløsning strukturer af makromolekskulære maskiner såsom ribosomer i forbindelse med det cellulære miljø7. Udnyttelsen af transmissionselektronmikroskopi er dog begrænset af prøvetykkelsen. Generelt er dette ikke et problem for enkelt-partikel cryo-EM, hvor optimering af vitrifikation betingelser i sidste ende kan resultere i indlejring af prøven i et tyndt lag af is. På den anden side er de fleste af cellerne faktisk ikke elektron gennemsigtige for 300 keV elektronstrålen. Den uelastiske middelvej i de vitrified biologiske prøver for 300 keV elektroner er ca 395 nm8, hvilket betyder, at cryo-ET undersøgelser er begrænset til den cellulære periferi for de fleste af cellerne.
Forskellige teknikker blev udviklet til at tynde prøven ned til en tilstrækkelig tykkelse for cryo-ET. Cryo-ultramicrotomi anvender mekanisk udskæring af prøven med en diamantkniv ved den flydende nitrogentemperatur (-196 °C) til at give 60-80 nm tykke sektioner, der er egnede til kryo-ET9,10,11. Flere sektioner kan fremstilles fra en enkelt celle, og dataanalysen kan i sidste ende producere 3D-strukturelle oplysninger for den større del af cellen. Den mekaniske udskæring kan dog forårsage flere artefakter som buede sektioner, sprækker eller prøvekomprimering, hvilket kan påvirke den resulterende struktur og skævvride kryo-ET-dataene10,11,12. Kryo-fokuseret ion stråle mikromaskiner (cryo-FIBM) repræsenterer en alternativ tilgang, hvor en tynd cellulær sektion er udarbejdet ved gradvis ablation af prøven ved hjælp af en fokuseret stråle af Ga + ioner (FIB) i en multi-trins proces, hvilket kan resultere i 80-300 nm tyk cellulær tværsnit (lamella)13,14,15 . I modsætning til kryo-ultramikrotomi fremstilles kun en lamella fra en enkelt celle, som repræsenterer ~ 0,3-3% af dens volumen, og mikromaskinering af flere celler er normalt nødvendigt for at finde et område af interesse i det fræsede tværsnit. Derudover er gennemløbet af hele arbejdsgangen i dag stadig ret lav, ofte begrænset til 6-8 lameller af høj kvalitet fra en 8-timers cryo-FIBM-session. På den anden side er cryo-FIBM-tværsnit blottet for kompressionsartefakter og giver passende input til kryo-ET i høj opløsning. Desuden er det ikke nødvendigt at overføre lamellerne til prøvebæreren til kryo-ET, da prøven opbevares på TEM-nettet under hele lamellaforberedelsesprocessen, og det samme net efterfølgende kan overføres til TEM. Vi forventer, at gennemløbet af cryo-FIBM vil blive væsentligt forbedret snart, primært fra tilgængeligheden af software til uovervåget lamella fræsning16,17 og udnyttelse af FIBs opererer på princippet om charge-par plasma, som vil give hurtigere materiale ablation.
Saccharomyces cerevisiae (gær) er eukaryote celler af sfærisk form og diameter på ~ 2-5 μm. Takket være sin størrelse, tilgængelighed, genetik, generationstid og simpel manipulation studeres gæren grundigt som en eukaryote modelorganisme i cellulær og molekylærbiologisk forskning svarende til Escherichia coli, som er godt undersøgt som en prokaryote modelorganisme i bakteriologi. Gæren kan let dyrkes i suspension og en høj mængde celler genereres på kort tid (fordoblingstid 1 – 2 timer). Endnu vigtigere, gær deler en kompleks intern cellulær struktur med dyre- og planteceller, samtidig med at et lille genom bestående af et lavt indhold af ikke-kodende DNA bevares. Strukturel karakterisering af gærpro proteomet fra in situ-dataene med høj opløsning kan således bidrage til at give en mekanistisk beskrivelse af den omfattende mængde funktionelle data, der er tilgængelige i litteraturen.
Heri leverer vi en omfattende protokol for erhvervelse af in situ cryo-ET-data om gærprøven, som dækker alle trin fra prøvedyrkningen ned til kryo-FIBM-lamellerpræparatet og prøveoverførslen til TEM til indsamling af kryo-ET-data.
Forberedelsen af celleprøverne til cryo-ET er en kompleks arbejdsgang, der kræver udnyttelse af flere avancerede instrumenter. Stikprøvekvaliteten kan kompromitteres under hvert forberedelsestrin, der påvirker hele protokollens gennemløb. Desuden udgør nødvendigheden af prøveoverførslen mellem de enkelte instrumenter en yderligere risiko for prøveforurening eller devitrifikation. Derfor er optimering af individuelle trin i prøveforberedelsesarbejdsgangen af stor betydning for at øge gennemløbet og reproducerbarheden af lamellaforberedelsesarbejdsgangen. Protokollen præsenteres her beskriver optimeret forberedelse af Saccharomyces cerevisiae til strukturel karakterisering af makromolekylære komplekser in situ af cryo-ET.
Protokollen beskriver forberedelsen af to typer gærprøver, der hovedsageligt adskiller sig i koncentrationen af cellerne på TEM-gitteret. Begge gærprøver gav lameller af høj kvalitet til kryo-ET, og udvælgelsen af prøvetypen kan foretages i overensstemmelse med målene i den pågældende undersøgelse. Gæren danner isolerede klynger af få celler tilfældigt spredt over gitteroverfladen i det første tilfælde, mens en kontinuerlig monolag af celler er til stede på TEM gitteroverfladen for den anden prøvetype. Førstnævnte er velegnet til hurtig lamellapræparat takket være den lille mængde af materialet, der skal fræses væk. Den endelige lamella er ret kort, og indeholder derfor kun 2-4 cellulære tværsnit. De områder, der er egnede til prøveforberedelse, fordeles tilfældigt over gitteroverfladen, herunder gitterkvalerne, hvilket delvis kan begrænse automatiseringen af arbejdsprocessen for lamellaforberedelse. Den sidste type af prøven kræver udnyttelse af større strømme i den indledende fræsningsfase for at bevare den samlede fræsetid. Derudover er denne type prøve mere tilbøjelig til artefakter, der stammer fra ujævn fræsning (gardin). Gis sprøjtes derfor på prøveoverfladen i en 50 % længere periode end i tilfælde af prøven med små cellulære klynger for at danne et tykkere beskyttende lag. Dernæst er prøven sputtered med et ekstra lag af Iridium (alternativt platin eller guld) for at helbrede GIS-laget, gøre det stivere og øge prøvens overfladeledningsevne. FIBM af yderligere områder på hver side af lamellerne (~ 2-5 μm fra lamellakanten) i løbet af det første trin af den uslebne lamellafræsning blev fundet gavnligt for at mindske antallet af knækkede lameller sandsynligvis på grund af nedsat spænding i det sidste tværsnit23. Den endelige lamella er lang og indeholder ~ 10 cellulære tværsnit, hvilket øger antallet af regioner, der er egnede til cryo-ET. Den ukorrekte vitrificering af mediet eller bufferen mellem cellerne kan let dæmpes ved tilsætning af kryo-protectanten til bufferopløsningen (5% glycerol, der anvendes i denne undersøgelse). Da de fleste firkanter er egnede til lameller forberedelse, prøven med celler organiseret i en kontinuerlig monolayer er velegnet til uovervåget lamella forberedelse.
Et andet vigtigt aspekt i lamella forberedelse arbejdsgangen er overførslen til transmission elektron mikroskop og korrekt positionering af lameller til mikroskop fase tilt akse. Optimalt er lamella hovedaksen vinkelret på tilt akse af mikroskopet, som giver sporing og fokus på højden af den afbildede region og forhindrer lamella kanter fra afskærmning synsfeltet ved høje hældning vinkler. Ved indsamling af cryo-ET-data ved hjælp af dosissymmetrisk ordning skal18 prøven i første omgang roteres i mikroskopet for at kompensere for lamellaens hældning med hensyn til gitterplanet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen og CIISB’s forskningsinfrastruktur, et Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi anerkender støtten fra Thermo Fisher Scientific Brno.
Agar | Himedia | MB053 | |
Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
Glycerol | Merck | G5516-1L | |
ethane | Messer | 1007 | |
LN2 | Lineq | LN2-1L | |
Peptone | Merck | P5905-1KG | |
Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
Tweezers | Dumont | T539 | |
Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Disposable | |||
Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
Equipment | |||
Autoclave | Systec | 101291545 | |
balances | BEL | M124A | |
Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |