Vi presenterer en protokoll for lamellforberedelse av dypfryste biologiske prøver ved kryofokusert ionstrålemikromaskinering for høyoppløselige strukturelle studier av makromolekyler in situ med kryo-elektrontomografi. Den presenterte protokollen gir retningslinjer for fremstilling av høykvalitets lameller med høy reproduserbarhet for strukturell karakterisering av makromolekyler inne i Saccharomyces cerevisiae.
I dag er kryo-elektrontomografi (cryo-ET) den eneste teknikken som kan gi næratomiske oppløsningsstrukturdata på makromolekylære komplekser in situ. På grunn av den sterke samspillet mellom en elektron med saken, er høyoppløselige cryo-ET-studier begrenset til prøver med en tykkelse på mindre enn 200 nm, noe som begrenser anvendbarheten av kryo-ET bare til de perifere områdene i en celle. En kompleks arbeidsflyt som består av utarbeidelse av tynne cellulære tverrsnitt ved kryofokusert ionstrålemikromaskinering (cryo-FIBM) ble introdusert i løpet av det siste tiåret for å muliggjøre innsamling av kryo-ET-data fra det indre av større celler. Vi presenterer en protokoll for fremstilling av cellulær lamell fra en prøve vitrified ved å stupe frysing ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som et prototypisk eksempel på en eukaryotisk celle med bred utnyttelse i cellulær og molekylærbiologisk forskning. Vi beskriver protokoller for vitrifisering av S. cerevisiae i isolerte flekker av noen få celler eller en kontinuerlig monolayer av cellene på et TEM-rutenett og gir en protokoll for lamellforberedelse ved kryo-FIB for disse to prøvene.
Nyere teknologisk og programvareutvikling har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) av vitrifiserte biologiske prøver en av de viktigste teknikkene i strukturell biologi forskning i det siste tiåret1,2. Utarbeidelsen av et eksemplar for kryo-EM består vanligvis av påføring av et renset protein eller et kompleks av protein med nukleinsyre på prøvebæreren (TEM-rutenett), etterfulgt av fjerning av det meste av væsken med et filterpapir, og dypp frysing av rutenettet med det gjenværende tynne laget av en prøve i flytende etan eller propan3. . Prøven er dermed festet i et tynt lag (vanligvis <80 nm) av amorf buffer i en fullt hydrert tilstand, ved nesten innfødte forhold, og uten behov for kjemisk fiksering eller tungmetallkontrast. Avbildning av den strukturelt homogene prøven i transmisjonselektronmikroskopet resulterer deretter i data som kan brukes til bestemmelse av makromolekylets tredimensjonale struktur ved nesten atomisk oppløsning ved hjelp av en enkelt partikkelanalyseprotokoll2. En slik in vitrostruktur tilsvarer representasjonen av makromolekylet under forholdene og behandlingen som brukes under prøvepreparering. Selv om strukturene som bestemmes under in vitro-forholdene vanligvis tilsvarer makromolekylets fullt funksjonelle tilstand, vil evnen til å bilde romlige relasjoner mellom ulike makromolekyler inne i cellen gi en ekstra funksjonell kontekst til strukturdataene.
Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) brukes til å rekonstruere 3D-volumer av pleomorfiske gjenstander eller makromolekylære komplekser in situ4,5. Fordelen med cryo-ET er at den tredimensjonale informasjonen oppnås ved å forestille seg en enkelt enhet. Imidlertid er oppløsningen der individuelle makromolekylære komplekser eller organeller observeres, svært begrenset. Derfor er gjennomsnitt av makromolekylene (sub-tomogram gjennomsnitt, STA) med samme struktur fra et større antall tomogrammer nødvendig for å nå 4-8 Å-oppløsningsmodeller fra cryo-ET-dataene6,7. Det har nylig blitt vist at kryo-ET og STA også kan brukes til å bestemme høyoppløselige strukturer av makromolekylære maskiner som ribosomer i sammenheng med det cellulære miljøet7. Bruken av transmisjonselektronmikroskopi er imidlertid begrenset av prøvetykkelsen. Generelt er dette ikke et problem for enpartikkel cryo-EM der optimalisering av vitrifiseringsforholdene til slutt kan resultere i innebygging av prøven i et tynt lag med is. På den annen side er de fleste cellene faktisk ikke elektron gjennomsiktige for 300 keV elektronstrålen. Den uelastiske gjennomsnittlige frie banen i vitrifiserte biologiske prøver for de 300 keV-elektronene er ca. 395 nm8, noe som betyr at kryo-ET-studier er begrenset til cellulær periferi for de fleste cellene.
Ulike teknikker ble utviklet for å tynne prøven ned til en tilstrekkelig tykkelse for kryo-ET. Cryo-ultramikrotomi benytter mekanisk kutting av prøven med en diamantkniv ved flytende nitrogentemperatur (-196 °C) for å gi 60-80 nm tykke seksjoner egnet for kryo-ET9,10,11. Flere inndelinger kan klargjøres fra en enkelt celle, og dataanalysen kan til slutt produsere 3D-strukturinformasjon for den største delen av cellen. Den mekaniske kuttingen kan imidlertid forårsake flere artefakter, for eksempel buede seksjoner, sprekker eller prøvekomprimering, noe som kan påvirke den resulterende strukturen og forutinnta cryo-ET-dataene10,11,12. Kryofokusert ionstrålemikromaskinering (cryo-FIBM) representerer en alternativ tilnærming der et tynt cellulært avsnitt fremstilles ved gradvis ablasjon av prøven ved hjelp av en fokusert stråle av Ga + ioner (FIB) i en flertrinnsprosess, noe som kan resultere i 80-300 nm tykt cellulært tverrsnitt (lamella)13,14,15 . I motsetning til kryo-ultramikrotomi fremstilles bare en lamell fra en enkelt celle, som representerer ~ 0,3-3% av volumet, og mikromaskinering av flere celler er vanligvis nødvendig for å finne en region av interesse i det fresede tverrsnittet. I tillegg er gjennomstrømningen av hele arbeidsflyten i dag fortsatt ganske lav, ofte begrenset til 6-8 høykvalitets lameller fra en 8-timers cryo-FIBM-økt. På den annen side er cryo-FIBM-tverrsnittene blottet for kompresjonsartefakter og gir passende innspill for høyoppløselig kryo-ET. Videre er overføringen av lamellen til prøvebæreren for kryo-ET ikke nødvendig, da prøven beholdes på TEM-rutenettet under hele lamellforberedelsesprosessen, og det samme rutenettet kan deretter overføres til TEM. Vi forventer at gjennomstrømningen av cryo-FIBM vil bli betydelig forbedret snart, hovedsakelig fra tilgjengeligheten av programvare for uovervåket lamell fresing16,17 og utnyttelse av FIBer som opererer på prinsippet om charge-couple plasma, som vil ha råd til raskere materialblasjon.
Saccharomyces cerevisiae (gjær) er eukaryote celler av sfærisk form og diameter på ~ 2-5 μm. Takket være sin størrelse, tilgjengelighet, genetikk, generasjonstid og enkel manipulasjon, blir gjæren grundig studert som en eukaryotisk modellorganisme i cellulær og molekylærbiologisk forskning som ligner Escherichia coli, som er godt studert som en prokaryotisk modellorganisme i bakteriologi. Gjæren kan lett dyrkes i suspensjon og en høy mengde celler genereres på kort tid (doblingstid 1 – 2 timer). Enda viktigere er at gjær deler en kompleks intern cellulær struktur med dyre- og planteceller samtidig som det beholder et lite genom som består av et lavt innhold av ikke-kodende DNA. Strukturell karakterisering av gjærproteomet fra høyoppløselige in situ-data kan dermed bidra til å gi en mekanistisk beskrivelse av den omfattende mengden funksjonelle data som er tilgjengelige i litteraturen.
Heri gir vi en omfattende protokoll for anskaffelse av in situ cryo-ET-data på gjærprøven, som dekker alle trinn fra prøvedyrkingen ned til kryo-FIBM lamellpreparatet, og prøveoverføringen til TEM for kryo-ET datainnsamling.
Utarbeidelsen av cellulære prøver for cryo-ET er en kompleks arbeidsflyt som krever utnyttelse av flere avanserte instrumenter. Prøvekvaliteten kan kompromitteres under hvert forberedelsestrinn som påvirker gjennomstrømningen til hele protokollen. I tillegg utgjør nødvendigheten av prøveoverføringen mellom enkeltinstrumenter en ekstra risiko for prøvekontaminering eller devitrifisering. Derfor er optimalisering av individuelle trinn i arbeidsflyten for prøveforberedelse av høy betydning for å øke gjennomstrømningen og reproduserbarheten til lamellforberedelsesarbeidsflyten. Protokollen som presenteres her beskriver den optimaliserte forberedelsen av Saccharomyces cerevisiae for strukturell karakterisering av makromolekylære komplekser in situ ved cryo-ET.
Protokollen beskriver utarbeidelsen av to typer gjærprøver som hovedsakelig varierer i konsentrasjonen av cellene på TEM-rutenettet. Begge gjærprøvene ga lameller av høy kvalitet for kryo-ET, og valg av prøvetype kan gjøres i samsvar med målene i den aktuelle studien. Gjæren danner isolerte klynger av få celler tilfeldig spredt over rutenettoverflaten i det første tilfellet, mens en kontinuerlig monolayer av celler er til stede på TEM-rutenettoverflaten for den andre prøvetypen. Førstnevnte er egnet for rask lamellforberedelse takket være det lille volumet av materialet som må freses bort. Den endelige lamellen er ganske kort, og inneholder derfor bare 2-4 cellulære tverrsnitt. Områdene som er egnet for prøvepreparering, fordeles tilfeldig over rutenettoverflaten, inkludert rutenettplassene, noe som delvis kan begrense automatiseringen av lamellforberedelsesarbeidsflyten. Sistnevnte type prøve krever utnyttelse av større strømmer i den første fresefasen for å beholde den totale fresetiden. I tillegg er denne typen prøve mer utsatt for gjenstander som stammer fra ujevn fresing (gardiner). Derfor er GIS sputtered på prøveoverflaten i en 50% lengre periode enn i tilfelle av prøven med små cellulære klynger for å danne et tykkere beskyttende lag. Deretter sputteres prøven med et ekstra lag Iridium (alternativt platina eller gull) for å kurere GIS-laget, gjøre det stivere og øke prøveoverflatens ledningsevne. FIBM av ekstra områder på hver side av lamellen (~ 2-5 μm fra lamellkanten) under det første trinnet i den grove lamellfresingen ble funnet gunstig for å redusere antall ødelagte lameller mest sannsynlig på grunn av redusert spenning i det endeligetverrsnittet 23. Den endelige lamellen er lang og inneholder ~ 10 cellulære tverrsnitt, noe som øker antall regioner som passer for kryo-ET. Feil vitrifisering av mediet eller bufferen mellom cellene kan lett dempes ved tilsetning av kryo-beskytteren til bufferløsningen (5% glyserol som brukes i denne studien). Siden de fleste rutene er egnet for lamellpreparat, er prøven med celler organisert i en kontinuerlig monolayer godt egnet for uovervåket lamellforberedelse.
Et annet viktig aspekt i lamellforberedelsesarbeidsflyten er overføringen til transmisjonselektronmikroskopet og riktig posisjonering av lamellen til mikroskopstadiets vippeakse. Optimalt er lamellens hovedakse vinkelrett på mikroskopets vippeakse som gir sporing og fokusering på høyden av den avbildede regionen og forhindrer lamellkantene i å skjerme synsfeltet i høye vippevinkler. Ved innsamling av kryo-ET-data ved hjelp av dosesymmetrisk skjema, bør18 prøven i utgangspunktet roteres i mikroskopet for å kompensere for lamellens helling med hensyn til rutenettplanet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen, og CIISB forskningsinfrastruktur, et Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi anerkjenner støtten fra Thermo Fisher Scientific Brno.
Agar | Himedia | MB053 | |
Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
Glycerol | Merck | G5516-1L | |
ethane | Messer | 1007 | |
LN2 | Lineq | LN2-1L | |
Peptone | Merck | P5905-1KG | |
Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
Tweezers | Dumont | T539 | |
Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Disposable | |||
Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
Equipment | |||
Autoclave | Systec | 101291545 | |
balances | BEL | M124A | |
Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |