Vi presenterar ett protokoll för lamella beredning av dopp frysta biologiska exemplar genom cryo-fokuserade jonstråle micromachining för högupplösta strukturella studier av makromolekyler på plats med cryo-elektron tomografi. Det presenterade protokollet innehåller riktlinjer för beredning av högkvalitativa lameller med hög reproducerbarhet för strukturell karakterisering av makromolekyler inuti Saccharomyces cerevisiae.
Idag är cryo-elektrontomografi (cryo-ET) den enda tekniken som kan ge nära atomupplösning strukturella data om makromolekylära komplex på plats. På grund av den starka interaktionen mellan en elektron och materian är högupplösta cryo-ET-studier begränsade till exemplar med en tjocklek av mindre än 200 nm, vilket begränsar tillämpligheten av cryo-ET endast till perifera regioner i en cell. Ett komplext arbetsflöde som omfattar beredning av tunna cellulära tvärsnitt genom kryofokuserad jonstrålemikromachining (cryo-FIBM) introducerades under det senaste decenniet för att möjliggöra förvärv av cryo-ET-data från de större cellernas inre. Vi presenterar ett protokoll för beredning av cellulära lameller från ett prov vitrified genom dopp frysning med hjälp av Saccharomyces cerevisiae som ett prototypiskt exempel på en eukaryotic cell med bred användning i cellulär och molekylärbiologi forskning. Vi beskriver protokoll för vitrifiering av S. cerevisiae i isolerade fläckar av några celler eller en kontinuerlig monolayer av cellerna på ett TEM rutnät och ger ett protokoll för lamella beredning av cryo-FIB för dessa två prover.
Den senaste tekniska utvecklingen och mjukvaruutvecklingen har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) av förrikade biologiska exemplar till en av de viktigaste teknikerna inom strukturbiologisk forskning under det senaste decenniet1,2. Beredningen av ett prov för kryo-EM består vanligtvis av applicering av ett renat protein eller ett komplex av protein med nukleinsyra på provbäraren (TEM-gallret), följt av avlägsnande av det mesta av vätskan med ett filterpapper, och doppa fryspunkten av nätet med det återstående tunna skiktet av ett prov i flytande etan eller propan3 . Provet är således fixerat i ett tunt skikt (vanligtvis <80 nm) av amorf buffert i helt hydratiserat tillstånd, vid nästan inhemska förhållanden och utan behov av kemisk fixering eller tungmetallkontrast. Avbildning av det strukturellt homogena provet i transmissionselektronmikroskopet resulterar sedan i data som kan användas för bestämning av makromolekylens tredimensionella struktur med nära atomupplösning med hjälp av ett enda partikelanalysprotokoll2. En sådan in vitro-struktur motsvarar makromolekylens representation under de förhållanden och den behandling som används under provberedningen. Även om de strukturer som bestäms under in vitro-förhållandena vanligtvis motsvarar makromolekylens fullt funktionella tillstånd, skulle förmågan att avbilda rumsliga relationer mellan olika makromolekyler inuti cellen ge ett ytterligare funktionellt sammanhang till strukturdata.
Cryo-elektrontomografi (cryo-ET) används för att rekonstruera 3D-volymer av pleomorfa objekt eller makromolekylära komplex på plats4,5. Fördelen med cryo-ET är att den tredimensionella informationen erhålls genom att avbilda en enda entitet. Den upplösning vid vilken enskilda makromolekylära komplex eller organeller observeras är dock mycket begränsad. Därför är medelvärdet av makromolekylerna (sub-tomogram genomsnitt, STA) med samma struktur från ett större antal tomograms nödvändigt för att nå 4-8 Å upplösningsmodeller från cryo-ET-data6,7. Det har nyligen visat sig att cryo-ET och STA också kan tillämpas för att bestämma högupplösta strukturer av makromolekylära maskiner som ribosomer i samband med cellmiljön7. Användningen av transmissionselektronmikroskopi begränsas dock av provexemplarets tjocklek. I allmänhet är detta inte ett problem för enpartikel cryo-EM där optimering av vitrifieringsförhållandena så småningom kan resultera i inbäddning av provet i ett tunt lager is. Å andra sidan är de flesta cellerna i själva verket inte elektron transparenta för 300 keV elektronstrålen. Den oelastiska genomsnittliga fria vägen i de förglasade biologiska exemplaren för de 300 keV-elektronerna är cirka 395 nm8, vilket innebär att cryo-ET-studier är begränsade till cellulär periferi för de flesta cellerna.
Olika tekniker utvecklades för att tunna ut provet till en tillräcklig tjocklek för cryo-ET. Cryo-ultramicrotomy använder mekanisk skivning av provet med en diamantkniv vid vätskekvävetemperaturen (-196 °C) för att ge 60-80 nm tjocka sektioner lämpliga för cryo-ET9,10,11. Flera avsnitt kan förberedas från en enda cell och dataanalysen kan så småningom producera 3D-strukturell information för större delen av cellen. Den mekaniska skivningen kan dock orsaka flera artefakter som böjda sektioner, sprickor eller provkomprimering, vilket kan påverka den resulterande strukturen och fördomen cryo-ET-data10,11,12. Cryo-fokuserad jonstrålemikromachining (cryo-FIBM) representerar ett alternativt tillvägagångssätt där en tunn cellulär sektion framställs genom gradvis ablation av provet med hjälp av en fokuserad stråle av Ga + joner (FIB) i en flerstegsprocess, vilket kan resultera i 80-300 nm tjockt cellulärt tvärsnitt (lamella)13,14,15 . I motsats till kryo-ultramicrotomy, endast en lamella är beredd från en enda cell, som representerar ~ 0,3-3% av dess volym, och mikromachining av flera celler är vanligtvis nödvändigt för att hitta en region av intresse för det frästa tvärsnittet. Dessutom är genomströmningen av hela arbetsflödet idag fortfarande ganska låg, ofta begränsad till 6-8 högkvalitativa lameller från en 8-timmars cryo-FIBM-session. Å andra sidan saknar cryo-FIBM-tvärsnitten några kompressionsartefakter och ger lämplig ingång för högupplöst cryo-ET. Dessutom är det inte nödvändigt att överföra lamellen till provbäraren för kryo-ET eftersom provet förvaras på TEM-nätet under hela lamellberedningsprocessen och samma rutnät därefter kan överföras till TEM. Vi förväntar oss att genomströmningen av cryo-FIBM kommer att förbättras avsevärt snart, främst från tillgång till programvara för oövervakad lamellfräsning16,17 och användning av FIB som arbetar enligt principen om laddningsparplasma, vilket kommer att ge snabbare materialablation.
Sackaromyces cerevisiae (jäst) är eukaryota celler av sfärisk form och diameter på ~2-5 μm. Tack vare sin storlek, tillgänglighet, genetik, generationstid och enkel manipulering studeras jästen i stor utsträckning som en eukaryota modellorganism i cellulär och molekylärbiologisk forskning som liknar Escherichia coli, som är väl studerad som en prokaryota modellorganism i bakteriologi. Jästen kan lätt odlas i suspension och en hög mängd celler genereras på kort tid (fördubblingstid 1 – 2 timmar). Ännu viktigare är att jäst delar en komplex intern cellulär struktur med djur- och växtceller samtidigt som den behåller ett litet genom som består av ett lågt innehåll av icke-kodande DNA. Strukturell karakterisering av jäst proteome från högupplösta in situ data kan således bidra till att ge en mekanistisk beskrivning för den omfattande mängden funktionella data som finns tillgängliga i litteraturen.
Häri tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för förvärv av in situ cryo-ET-data om jästprovet, som täcker alla steg från provodlingen ner till kryo-FIBM-lamellaberedningen och provöverföringen till TEM för kryo-ET-datainsamling.
Beredningen av cellulära prover för cryo-ET är ett komplext arbetsflöde som kräver användning av flera avancerade instrument. Exempel kvaliteten kan äventyras under varje förberedelse steg som påverkar genom flödet för hela protokollet. Dessutom utgör behovet av provöverföring mellan enskilda instrument ytterligare en risk för kontaminering av prover eller avvitrifiering. Därför är optimering av enskilda steg i arbetsflödet för prov förberedelse av stor betydelse för att öka genomströmningen och reproducerbarheten för arbetsflödet för lamella förberedelse. Protokollet som presenteras här beskriver optimerade beredningen av Saccharomyces cerevisiae för strukturell karakterisering av makromolekylära komplex på plats av cryo-ET.
Protokollet beskriver beredningen av två typer av jästprover som huvudsakligen skiljer sig åt i cellernas koncentration på TEM-nätet. Båda jästproverna gav högkvalitativa lameller för kryo-ET och val av provtyp kan göras i enlighet med målen för den specifika studien. Jästen bildar isolerade kluster av få celler slumpmässigt utspridda över rutnätsytan i det första fallet, medan det finns ett kontinuerligt monoskikt av celler på TEM-rutnätets yta för den andra provtypen. Den förstnämnda är lämplig för snabb lamellberedning tack vare den lilla volymen av materialet som måste fräsas bort. Den slutliga lamellen är ganska kort och innehåller därför endast 2-4 cellulära tvärsnitt. De områden som lämpar sig för provberedning är slumpmässigt fördelade över rutnätsytan, inklusive rutnätsrutorna, vilket delvis kan begränsa automatiseringen av arbetsflödet för lamellaberedning. Den senare typen av provexemplar kräver användning av större strömmar under den inledande fräsfasen för att behålla den totala frästiden. Dessutom är denna typ av prov mer benägna att artefakter som härrör från ojämn fräsning (ridå). Därför sputteras GIS på provytan under en 50% längre period än i fallet med provet med små cellulära kluster för att bilda ett tjockare skyddsskikt. Därefter sputteras provet med ytterligare ett lager Iridium (alternativt platina eller guld) för att härda GIS-skiktet, göra det styvare och öka provytans ledningsförmåga. FIBM av ytterligare områden på varje sida av lamellen (~ 2-5 μm från lamellkanten) under det första steget i den grova lamellfräsningen befanns fördelaktigt för att minska antalet brutna lameller troligen på grund av minskad spänning i det slutliga tvärsnittet23. Den slutliga lamellen är lång och innehåller ~ 10 cellulära tvärsnitt, vilket ökar antalet regioner som är lämpliga för cryo-ET. Felaktig vitrifiering av mediet eller bufferten mellan cellerna kan lätt dämpas genom tillsats av kryoskyddsmedlet till buffertlösningen (5% glycerol som används i denna studie). Eftersom de flesta av rutorna är lämpliga för lamellaberedning är provet med celler organiserade i ett kontinuerligt monoskikt väl lämpat för oövervakad lamellberedning.
En annan viktig aspekt i lamellaberedningsarbetsflödet är överföringen till transmissionselektronmikroskopet och korrekt placering av lamellen till mikroskopstegets lutningsaxel. Optimalt är lamellens huvudaxel vinkelrät mot mikroskopets lutningsaxel som ger spårning och fokusering på höjden av det avbildade området och förhindrar att lamellkanterna skyddar synfältet i höga lutningsvinklar. Vid insamling av cryo-ET-data med dossymmetriskt schemaska 18 provet först roteras i mikroskopet för att kompensera för lamellens lutning med avseende på gallerplanet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansierat av Horisont 2020-programmet i Europeiska kommissionen, och CIISB:s forskningsinfrastruktur, ett Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi erkänner stödet från Thermo Fisher Scientific Brno.
Agar | Himedia | MB053 | |
Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
Glycerol | Merck | G5516-1L | |
ethane | Messer | 1007 | |
LN2 | Lineq | LN2-1L | |
Peptone | Merck | P5905-1KG | |
Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
Tweezers | Dumont | T539 | |
Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Disposable | |||
Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
Equipment | |||
Autoclave | Systec | 101291545 | |
balances | BEL | M124A | |
Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |