마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성
Summary
여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.
Abstract
이 작품은 복잡한 다층 조직을 생성 할 수있는 잠재력을 가진 새롭고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 미세 유체 플랫폼을 제공합니다. 개념의 증거로, 진피 (기질)와 표피 (상피) 구획을 포함하는 단순화되고 미분화되지 않은 인간 피부를 모델링했습니다. 이를 위해, 2개의 챔버로 나뉘어진 다목적이고 견고한 비닐 계열 장치가 개발되어 고가의 특수 장비의 사용 또는 소형 소수성 분자 및 단백질의 흡수와 같은 생물 의학 응용을 위한 다디메틸실록산(PDMS)을 기반으로 한 미세 유체 장치에 존재하는 몇 가지 단점을 극복했습니다. 더욱이, 병렬 흐름을 기반으로 하는 새로운 방법이 개발되어 진피 및 표피 구획모두의 시상증을 가능하게 하였다. 피부 구조는 인간 1 차 섬유아세포와 위에 시드된 불멸의 각질 세포의 단층이 포함된 피브린 매트릭스로 이루어져 있으며, 이는 이후 동적 배양 조건하에서 유지됩니다. 이 새로운 미세 유체 플랫폼은 인간의 피부 질환을 모델링하고 다른 복잡한 조직을 생성하는 방법을 추정 할 수있는 가능성을 엽니 다.
Introduction
최근에는 화장품 및 의약품의 독성 분석을 위한 체외 인체 피부 모델의 개발 및 생산을 향한 발전이 이루어지고있다. 제약 및 스킨 케어 산업의 연구원은 동물을 사용하고있다, 마우스가 가장 일반적인되고, 자신의 제품을 테스트하기 위해2,3,4,5. 그러나, 동물에 대한 제품을 테스트하는 것은 인간에서 항상 반응을 예측하는 것은 아니며, 이는 종종 인간에서 약물 실패 또는 부작용으로 이어지며 결과적으로 경제적 손실5,6. 영국은 1998년에 화장품 검사를 위해 동물을 사용하는 것을 금지한 최초의 국가였습니다. 이후 2013년 EU는 동물 화장품 의 검사 및 승인을 금지했다(EU 화장품 규정 제1223호/2009)7.
이 금지는 미국8의‘휴먼 화장품 법’과 같은 다른 국가에서도 고려되고 있습니다. 윤리적 관심사 외에도 동물과 인간의 피부 사이의 해부학적 차이는 동물 실험을 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 종종 비효율적입니다. 또한, 2025년9년까지전 세계 체외 독성 검사 시장 규모는 2698억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. 이러한 이유로, 동물을 사용하지 않고 화장품과 약물의 안전성과 독성 효과에 대한 테스트를 가능하게 하는 생체 공학 인간 피부 모델과 같은 체외 연구를 위한 새로운 방법과 대안을 개발할 필요가 있습니다.
시험관, 인간 피부 모델에서 두 가지 종류의 시판이 가능합니다. 첫 번째 유형은 서로 다른 재료에 시드되는 각질 세포의 여러 층을 포함하는 계층화된 표피 등가물로 구성됩니다. 이들 중 일부는 경제협력개발기구(OECD)의 승인을 받았으며, EpiDerm 또는 SkinEthic10,11,12와같은 피부 부식 및 자극 테스트를 위한 대안방법 검증을 위한 유럽 센터(ECVAM)에 의해 검증되었다. 두 번째 유형은 T-Skin 및 EpiDerm-FT와 같은 섬유아세포가 함유된 3차원(3D) 비계에 시드된 인간 각질 세포를 분화하는 층이 있는 전체 피부 등가물입니다. 그러나, 이 모형은 정확하게 인간적인 생리적인 조건을 나타낼 수 없는 정적인 조건하에서 배양됩니다.
최근 관심은 동적 관류13,14,15,16,17,18,19를가진 세포 배양 삽입 (CCI) 형식으로 체외 3D 피부 모델을 생성하는 데 초점을 맞추고있다. 그러나 이러한 시스템은 현장에서의 고전적인 정의에 따라 미세 유체 피부 온 칩으로 엄격하다고 간주 할 수 없습니다. 장기에 칩에 대한 Ingber의 정의는 장기가 미세 유체 채널 내부에 배치되어야한다고 명시, 이는 단지 몇 장치가20을충족하는 조건입니다20,21. 스킨 온 칩은 지금까지 다공성 멤브레인22,23로분리된 단세포 층 및/또는 진피 세포 층으로서 대부분 간단한 상피를 모델링하였다. 미세 유체 시스템16,24에서피부를 모델링하는 몇 가지 발전이 있었지만, 현재 잉버의 정의에 맞는 장기 온 – 어 칩 시스템을 보여주는 문헌이 없다, 장소에서 다층 피부를 생성 할 수 및 상피 및 기질 구성 요소를 모두 포함.
이 작품에서는 스킨 온-어칩 애플리케이션을 위한 새롭고 비용 효율적이고 견고한 비닐 기반 의 미세 유체 플랫폼이 제공됩니다. 이 플랫폼은 PDMS25의일부 한계를 극복하면서 제조 공정에서 보다 단순하고 장치 레이아웃의 유연성과 다기능성을 높이는 마이크로 가공에 의해 생산되었습니다. 주사기 펌프로 제어되는 병렬 흐름을 통해 단순화된 피부 구조를 도입하는 방법도 설계되었습니다. 병렬 흐름은 매우 다른 점도 (이 경우 버퍼 및 피브린 프리 젤)를 가진 두 유체가 서로 혼합하지 않고 채널을 통해 침투 할 수 있게합니다. 개념의 증거로서, 진피를 모방한 피브린 매트릭스에 내장된 섬유아세포를 함유한 진피 분체 구조가 장치에 도입되었으며, 그 위에 각질 세포의 단층이 장화되어 미분화 표피를 모방하였다. 진피 구획 높이는 유량을 수정하여 변조될 수 있다. 이 작품의 주요 참신함은, 이전에 설명된모델(22,26,27,28,29)에비해 미세유체제를 통해 마이크로챔버 내부의 3D 구조의 개발이다. 이 문서는 단순화 된 미분화 피부를 제공하지만, 장기적인 목표는 생성하고 약물 및 화장품 테스트 목적으로 의 생존력과 기능을 보여주기 위해 완전히 차별화 된 피부 구조를 특성화하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법을 개발하는 동기는 피부 질환을 모델링하고 높은 처리량 플랫폼에서 새롭고 혁신적인 치료법의 효과를 연구하려는 욕구였습니다. 현재까지 이 실험실은 수동적으로 또는 3D 바이오 프린팅 기술의 도움으로 이러한 진모 표피 등가물을 생성합니다- 섬유아세포가 있는 피브린 젤은 세포 배양 삽입 플레이트에 삽입하고 그 위에 각질 세포를 파종합니다. 각질 세포가 합류하면 3D 배양은 각질 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
하비에르 로드리게스 박사, 마리아 루이사 로페즈 박사, 카를로스 마텔란, 후안 프란시스코 로드리게스에게 매우 유용한 제안, 토론 및/또는 예비 데이터에 진심으로 감사드립니다. 또한 세르지오 페른란데스, 페드로 헤레로스, 라라 스톨젠부르크의 공헌에 감사드립니다. GFP 라벨hF와 hKC에 대한 박사 마르타 가르시아에 특별한 감사. 마지막으로, 기예르모 비즈카이노와 앙겔리카 코랄의 뛰어난 기술 적 지원을 인정합니다. 이 작품은 “Programa de Actividades de I+D 엔트레 그루포스 드 Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 “Programa de excelencia”, 프로젝트 EPUC3M03, CAM에 의해 지원되었습니다. 콘세예리아 드 EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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