Her presenterer vi en protokoll for å generere en tredimensjonal forenklet og uavklart hudmodell ved hjelp av en mikromaskinert mikrofluidisk plattform. En parallell strømningstilnærming tillater in situ-avsetning av et dermalt rom for såing av epitelceller på toppen, alt kontrollert av sprøytepumper.
Dette arbeidet presenterer en ny, kostnadseffektiv og pålitelig mikrofluidisk plattform med potensial til å generere komplekse flerlagsvev. Som et konseptbevis er en forenklet og uavklart menneskelig hud som inneholder en dermal (stromal) og et epidermalt (epitel) rom blitt modellert. For å oppnå dette har en allsidig og robust, vinylbasert enhet delt inn i to kamre blitt utviklet, og overvinner noen av ulempene som er tilstede i mikrofluidiske enheter basert på polydimetylsiloksan (PDMS) for biomedisinske applikasjoner, for eksempel bruk av dyrt og spesialisert utstyr eller absorpsjon av små, hydrofobe molekyler og proteiner. Videre ble det utviklet en ny metode basert på parallell strømning, noe som muliggjør in situ-avsetning av både dermale og epidermale rom. Hudkonstruksjonen består av en fibrinmatrise som inneholder menneskelige primære fibroblaster og en monolayer av udødeliggjorte keratinocytter frøet på toppen, som senere opprettholdes under dynamiske kulturforhold. Denne nye mikrofluidiske plattformen åpner muligheten for å modellere menneskelige hudsykdommer og ekstrapolere metoden for å generere andre komplekse vev.
Nylig har det blitt gjort fremskritt mot utvikling og produksjon av in vitro menneskelige hudmodeller for analyse av toksisiteten til kosmetiske og farmasøytiske produkter1. Forskere i farmasøytisk og hudpleieindustri har brukt dyr, mus er de vanligste, for å teste sine produkter2,3,4,5. Imidlertid er testing av produkter på dyr ikke alltid prediktivt for responsen hos mennesker, noe som ofte fører til narkotikasvikt eller bivirkninger hos mennesker og følgelig til økonomiske tap5,6. Storbritannia var det første landet som forbød bruk av dyr til kosmetisk testing i 1998. Senere, i 2013, forbød EU testing og godkjennelse av kosmetikk hos dyr (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.
Dette forbudet vurderes også av andre land som i ‘The Humane Cosmetics Act’ i USA8. I tillegg til etiske bekymringer gjør de anatomiske forskjellene mellom dyr og menneskelig hud dyreforsøk tidkrevende, dyre og ofte ineffektive. Videre forventes den globale in vitro toksikologitestingsmarkedets størrelse å nå 26,98 milliarder USD innen 20259. Av disse grunnene er det behov for å utvikle nye metoder og alternativer for de in vitro-studiene, for eksempel bioengineered menneskelige hudmodeller, som muliggjør testing for sikkerhet og toksiske effekter av kosmetikk og narkotika uten bruk av dyr.
Det finnes to forskjellige typer kommersielt tilgjengelige, in vitro, menneskelige hudmodeller. Den første typen består av stratifiserte epidermale ekvivalenter som inneholder flere lag med differensierende keratinocytter som er frøet på forskjellige materialer. Noen av dem er godkjent av Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) og validert av (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) for hudkorrosjon og irritasjonstesting, for eksempel EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andre typen er full-skin ekvivalenter med et lag av differensiering menneskelig keratinocytter frøet på en tredimensjonal (3D) stillas som inneholder fibroblaster, for eksempel T-Skin og EpiDerm-FT. Imidlertid dyrkes disse modellene under statiske forhold, noe som gjør at de ikke kan representere menneskelige fysiologiske forhold nøyaktig.
Nylig interesse har fokusert på å generere in vitro 3D-hudmodeller i cellekulturinnsettingsformater (CCI) med dynamisk perfusjon13,14,15,16,17,18,19. Imidlertid kan disse systemene ikke betraktes som stricto sensu som mikrofluidisk hud-på-chips i henhold til deres klassiske definisjon i feltet. Ingbers definisjon for organer-på-en-chip sier at orgelet må plasseres inne i mikrofluidiske kanaler, noe som er en betingelse at bare noen få enheter oppfyller20,21. Skin-on-chips har så langt modellert for det meste enkle epithelia som encellede lag og / eller dermale cellelag skilt av en porøsmembran 22,23. Selv om det har vært noen fremskritt modellering hud i mikrofluidiske systemer16,24, det er for tiden ingen litteratur som viser et organ-on-a-chip system som passer Ingber definisjon, i stand til å produsere en flerlags hud in situ og inkludert både epitelial og stromal komponenter.
I dette arbeidet presenteres en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbasert mikrofluidisk plattform for hud-på-en-chip-applikasjoner. Denne plattformen ble produsert av mikrobearbeiding, som gir mer enkelhet i fabrikasjonsprosessen, samt økt fleksibilitet og allsidighet i utformingen av enheten, og overvinner noen av begrensningene til PDMS25. En måte å introdusere en forenklet hudkonstruksjon gjennom en parallell strømning kontrollert med sprøytepumper ble også designet. Parallell strømning gjør at to væsker med svært forskjellige viskositeter (en buffer og fibrin pre-gel i dette tilfellet) kan perfunderes gjennom en kanal uten å blande seg med hverandre. Som et konseptbevis ble en dermo-epidermal konstruksjon som inneholder fibroblaster innebygd i en fibrinmatrise som etterligner dermis introdusert i enheten, på toppen av hvilken en monolayer av keratinocytter ble lastet for å etterligne den uavklarte epidermis. Høyden på det dermale rommet kan moduleres ved å endre strømningshastighetene. Hovednyheten i dette arbeidet, sammenlignet med tidligere beskrevne modeller22,26,27,28,29, er utviklingen av en 3D-konstruksjon inne i en mikrokammer ved hjelp av mikrofluidikk. Selv om denne artikkelen presenterer en forenklet undifferentiated hud, er det langsiktige målet å generere og karakterisere en fullt differensiert hudkonstruksjon for å demonstrere sin levedyktighet og funksjonalitet for narkotika- og kosmetiske testformål.
Motivasjonen for å utvikle denne metoden var ønsket om å modellere hudsykdommer og studere effekten av nye og innovative terapier i en plattform med høy gjennomstrømning. Til dags dato produserer dette laboratoriet disse dermo-epidermale ekvivalentene ved å støpe- enten manuelt eller ved hjelp av 3D-bioprintingsteknologien – fibringelen med fibroblaster i en cellekulturinnleggsplate og sådd keratinocyttene på toppen av den. Når keratinocyttene når samløp, blir 3D-kulturen utsatt for luftvæskegrensesnittet, s…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker oppriktig Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán og Juan Francisco Rodríguez for svært nyttige forslag, diskusjoner og / eller foreløpige data. Vi takker også bidragene fra Sergio Férnandez, Pedro Herreros og Lara Stolzenburg til dette prosjektet. Spesiell takk gå til Dr. Marta García for GFP-merket hFB og hKCs. Til slutt anerkjenner vi den utmerkede tekniske hjelpen til Guillermo Vizcaíno og Angélica Corral. Dette arbeidet ble støttet av “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dette arbeidet ble også støttet av “Programa de excelencia”, Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
Culture plates | Fisher | ||
DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
Glass slide | Thermo Scientific | ||
GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
Live/dead kit | Invitrogen | ||
PBS | Sigma Aldrich | ||
Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
Syringes | Terumo | 5 mL | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |