JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Generering av en förenklad tredimensionell hud-på-ett-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

Published: May 17, 2021
doi:
10.3791/62353
, , , ,
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering,Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology,Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine,CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att generera en tredimensionell förenklad och odifferentierad hudmodell med hjälp av en mikromaskin mikrofluidisk plattform. En parallell flödesmetod gör det möjligt att in situ deponera ett hudfack för sådd av epitelceller ovanpå, allt styrt av sprutpumpar.

Abstract

Detta arbete presenterar en ny, kostnadseffektiv och pålitlig mikrofluidisk plattform med potential att generera komplexa flerskiktsvävnader. Som ett konceptbevis har en förenklad och odifferentierad mänsklig hud som innehåller en dermal (stromal) och ett epidermalt (epitelial) fack modellerats. För att uppnå detta har en mångsidig och robust, vinylbaserad enhet uppdelad i två kammare utvecklats, övervinna några av nackdelarna som finns i mikrofluidiska enheter baserade på polydimethylsiloxan (PDMS) för biomedicinska tillämpningar, såsom användning av dyr och specialiserad utrustning eller absorption av små, hydrofoba molekyler och proteiner. Dessutom utvecklades en ny metod baserad på parallella flöden, vilket möjliggör in situ-deponering av både dermala och epidermal avdelningar. Hudkonstruktionen består av en fibrinmatris som innehåller mänskliga primära fibroblaster och ett monoskikt av odödliga keratinocyter sådda ovanpå, som därefter upprätthålls under dynamiska odlingsförhållanden. Denna nya mikrofluidiska plattform öppnar möjligheten att modellera mänskliga hudsjukdomar och extrapolera metoden för att generera andra komplexa vävnader.

Introduction

Nyligen har framsteg gjorts mot utveckling och produktion av in vitro mänskliga hudmodeller för analys av toxiciteten hos kosmetiska och farmaceutiska produkter1. Forskare inom läkemedels- och hudvårdsindustrin har använt djur, möss är de vanligaste, för att testa sina produkter2,3,4,5. Testprodukter på djur är dock inte alltid förutsägande av svaret hos människor, vilket ofta leder till läkemedelssvikt eller negativa effekter hos människor och följaktligen till ekonomiska förluster5,6. Förenade kungariket var det första land som förbjöd användning av djur för kosmetisk testning 1998. Senare, 2013, förbjöd EU testning och approbation av kosmetika hos djur (EU:s kosmetikalagstiftning nr 1223/2009)7.

Detta förbud övervägs också av andra länder, t.ex. Förutom etiska problem gör de anatomiska skillnaderna mellan djur- och mänsklig hud djurförsök tidskrävande, dyra och ofta ineffektiva. Dessutom förväntas den globala marknaden för in vitro-toxikologitestning uppgå till 26,98 miljarder US-dollar år 20259. Av dessa skäl finns det ett behov av att utveckla nya metoder och alternativ för in vitro-studier, såsom bioengineered humana hudmodeller, som möjliggör testning av säkerhet och toxiska effekter av kosmetika och läkemedel utan användning av djur.

Det finns två olika typer av kommersiellt tillgängliga, in vitro, mänskliga hudmodeller. Den första typen består av stratifierade epidermala ekvivalenter som innehåller flera lager av differentierande keratinocyter som är sådda på olika material. Några av dem har godkänts av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) och godkänts av (Europeiska centrumet för validering av alternativa metoder (ECVAM) för hudkorrosion och irritationstestning, såsom EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andra typen är fullhudsekvivalenter med ett lager av differentierande mänskliga keratinocyter sådda på en tredimensionell (3D) byggnadsställning som innehåller fibroblaster, såsom T-Skin och EpiDerm-FT. Dessa modeller odlas dock under statiska förhållanden, vilket gör att de inte kan representera mänskliga fysiologiska förhållanden korrekt.

Det senaste intresset har fokuserat på att generera in vitro 3D-hudmodeller i cellodlingsinsatsformat (CCI) med dynamisk perfusion13,14,15,16,17,18,19. Dessa system kan dock inte betraktas som stricto sensu som mikrofluidiska skin-on-chips enligt deras klassiska definition på fältet. Ingbers definition för organ på ett chip anger att organet måste placeras inuti de mikrofluidiska kanalerna, vilket är ett villkor att endast ett fåtal enheter uppfyller20,21. Skin-on-chips har hittills modellerat mestadels enkel epitel som encelliga lager och/eller hudcelllager åtskilda av ett poröst membran22,23. Även om det har gjorts några framsteg modellering av huden i mikrofluidiska system16,24, finns det för närvarande ingen litteratur som visar ett organ-på-ett-chip-system som passar Ingbers definition, som kan producera en flerskiktad hud på plats och inklusive både epitelala och stromala komponenter.

I detta arbete presenteras en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbaserad mikrofluidisk plattform för hud-på-ett-chip-applikationer. Denna plattform producerades genom mikrobearbetning, vilket ger mer enkelhet i tillverkningsprocessen, liksom ökad flexibilitet och mångsidighet i enhetens layout, övervinna några av begränsningarna i PDMS25. Ett sätt att införa en förenklad hudkonstruktion genom ett parallellt flöde som styrs med sprutpumpar utformades också. Parallellt flöde gör att två vätskor med mycket olika viskositeter (en buffert och fibrin pre-gel i detta fall) kan perfuseras genom en kanal utan att blandas med varandra. Som ett bevis på koncept introducerades en dermo-epidermal konstruktion som innehåller fibroblaster inbäddade i en fibrin matris som härma dermis i enheten, ovanpå vilken en monolayer av keratinocyter laddades för att efterlikna odifferentierade epidermis. Dermal kupéhöjden kan moduleras genom att ändra flödeshastigheterna. Huvudförfattaren i detta arbete, jämfört med tidigare beskrivna modeller22,26,27,28,29, är utvecklingen av en 3D-konstruktion inuti en mikrokammare med hjälp av mikrofluidik. Även om denna artikel presenterar en förenklad odifferentierad hud, är det långsiktiga målet att generera och karakterisera en helt differentierad hudkonstruktion för att visa dess livskraft och funktionalitet för läkemedels- och kosmetiska teständamål.

Protocol

1. Parametrar för spåndesign och mikrotillverkning Designa de mikrofluidiska spånskikten med FreeCAD öppen källkodsdesignprogramvara; se tabell 1 för kanalernas dimensioner. Inkludera fyra hål med diametern 2,54 mm i designen för att använda en skräddarsydd aligner för en korrekt lager superposition. Längd (μm) Bredd (μm) <…

Representative Results

Det designade chipet består av två fluida kammare åtskilda av ett 5 μm porstorlek PC-membran som möjliggör tillväxten av cellen genom att tillåta passage av tillväxtfrämjande molekyler från den nedre kammaren. Den övre kammaren håller vävnad konstruktion, i detta fall, en monolayer av hKCs på en fibrin hydrogel som innehåller hFBs. Kanalernas höjd bestäms av antalet självhäftande ark som läggs till varje kanal. Den nedre kammaren består av 4 lager (380 μm) och det övre …

Discussion

Motivationen att utveckla denna metod var viljan att modellera hudsjukdomar och studera effekterna av nya och innovativa terapier i en plattform med hög genomströmning. Hittills producerar detta laboratorium dessa dermo-epidermal motsvarigheter genom gjutning-antingen manuellt eller med hjälp av 3D bioprinting teknik-fibrin gel med fibroblaster i en cell kultur infoga tallrik och så keratinocyter ovanpå den. När keratinocyterna når sammanflöde utsätts 3D-kulturen för luft-vätskegränssnittet, vilket inducerar …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar verkligen Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán och Juan Francisco Rodríguez för mycket användbara förslag, diskussioner och / eller preliminära data. Vi tackar också Sergio Férnandez, Pedro Herreros och Lara Stolzenburgs bidrag till detta projekt. Särskilt tack till Dr. Marta García för GFP-märkta hFBs och hKCs. Slutligen erkänner vi guillermo Vizcaínos och Angélica Corrals utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Detta arbete stöddes också av “Programa de excelencia”, Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

Materials

Amchafibrin Rottafarm Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride Sigma Aldrich
Culture plates Fisher
DMEM Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil ATP Adhesive Systems GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter Brother Scanncut CM900
FBS Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen Sigma Aldrich Extracted from human plasma
Glass slide Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts – Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line ATCC Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit Invitrogen
PBS Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane Merk TM 5 µm pore size
Polydimethylsiloxane Dow Corning Sylgard 184
Sodium chloride Sigma Aldrich
Syringes Terumo 5 mL
Thrombin Sigma Aldrich 10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl Mactac JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich
Tubing IDEX Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  3. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
  4. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  5. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
  6. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  7. Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).
  8. H.R.2858 – Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016)
  9. . Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015 Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share–trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018)
  10. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
  11. OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
  12. Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
  13. vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
  14. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  15. Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
  16. Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
  17. Materne, E. -. M., et al. The multi-organ chip – a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
  18. Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioingegneria. 5 (2), 43 (2018).
  19. Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
  20. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  21. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
  23. Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
  24. Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
  25. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  26. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  27. Huh, D. A human disease model of drug toxicity – induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
  28. Beckwitt, C. H., et al. Liver ‘ organ on a chip ‘. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
  29. Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
  30. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  31. Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
  32. Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
  33. Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
  34. Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
  35. Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
  36. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
  37. Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
  38. Marx, U., et al. Human-on-a-chip’ developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
  39. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  40. Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
  41. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
  42. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  43. O’Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
  44. Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).

Tags

3D Skin-on-a-chipMicromachinedMicrofluidic PlatformVinyl LayersParallel-flowDrug TestingCosmetic TestingHigh-throughput ScreeningSimplified FabricationLithography-freePDMSPolycarbonate MembraneAdhesiveSterilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Risueño, I., Valencia, L., Holgado, M., Jorcano, J. L., Velasco, D. Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (171), e62353, doi:10.3791/62353 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image