μTongue: वीवो में जीभ के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक्स आधारित कार्यात्मक इमेजिंग प्लेटफॉर्म
Summary
लेख जीभ पर एक इंट्राविटल इमेजिंग खिड़की में माइक्रोफ्लुइडिक्स को एकीकृत करके वीवो में कार्यात्मक स्वाद सेल इमेजिंग के लिए μTongue (माइक्रोफ्लुइडिक्स-ऑन-ए-जीभ) डिवाइस का परिचय देता है।
Abstract
इंट्राविटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक उपकरण है जो जीवित जानवर में बहुकोशिकीय गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, स्वाद संवेदी अंग में इसका सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है। इंट्राविटल जीभ इमेजिंग विंडो में माइक्रोफ्लुइडिक्स को एकीकृत करके, μTongue कई टैक्ट्स के लिए नियंत्रित जोखिम के तहत वीवो में स्वाद कोशिकाओं की विश्वसनीय कार्यात्मक छवियां प्रदान करता है। इस पत्र में, μTongue प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। पांच उपधाराएं हैं: टैक्टेंट समाधानों की तैयारी, माइक्रोफ्लुइडिक मॉड्यूल की स्थापना, नमूना बढ़ते, कार्यात्मक छवि डेटा प्राप्त करना, और डेटा विश्लेषण। μTongue का उपयोग करते समय उत्पन्न होने वाले व्यावहारिक मुद्दों को हल करने के लिए कुछ सुझाव और तकनीक भी प्रस्तुत की जाती हैं।
Introduction
इंट्राविटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग जीवित ऊतकों पर स्पेटियोटेम्परल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। शोधकर्ता तेजी से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर विकसित कर रहे हैं जो जैविक प्रक्रियाओं के विशिष्ट और संवेदनशील परिवर्तनों को फ्लोरेसेंस संकेतों में प्रदान करते हैं – जिन्हें फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आसानी से दर्ज किया जा सकता है जो व्यापक रूप से उपलब्ध हैं1,2. यद्यपि कृंतक में अधिकांश आंतरिक अंगों की माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई है, लेकिन जीभ पर इसका सफल अनुप्रयोग अभी तक सफल नहीं हुआ है3।
स्वाद कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग पर पिछले अध्ययनों को जीभ के ऊतकों को पतला-खंडित करके पूर्व वीवो आयोजित किया गया था ताकि परिधि स्वाद प्राप्त किया जा सके4,5,6 या कवकरूप स्वाद प्राप्त करने के लिए स्वाद एपिथेलियम को छीलकर7,8। इन नमूनों की तैयारी अनिवार्य रूप से आक्रामक थी, इस प्रकार नसों के अंतर्मन, पारमेबिलिटी बाधाओं और रक्त परिसंचरण जैसे प्राकृतिक माइक्रोएनवायरमेंट काफी हद तक बेफिक्र थे। पहली इंट्राविटल जीभ इमेजिंग विंडो 2015 में चोई एट अल द्वारा सूचित की गई थी, लेकिन तरल टैक्टेंट उत्तेजनाओं के कारण आंदोलन और ऑप्टिकल कलाकृतियों के कारण विश्वसनीय कार्यात्मक रिकॉर्डिंग प्राप्त नहीं की जा सकतीथी।
हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक्स-ऑन-ए-जीभ (μTongue)10पेश किया गया था । यह डिवाइस माउस जीभ पर इमेजिंग विंडो के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को एकीकृत करता है। इमेजिंग अवधि के दौरान टैक्टेंट उत्तेजनाओं के अर्ध-स्थिर-राज्य प्रवाह को प्राप्त करके, तरल गति से कलाकृतियों को कम किया जासकता है (चित्र 1)। इनपुट पोर्ट को मल्टीचैनल प्रेशर कंट्रोलर्स की एक श्रृंखला द्वारा खिलाया जाता है, जबकि आउटपुट पोर्ट एक सिरिंज पंप से जुड़ा होता है, जो ०.३ एमएल/मिन रखता है । इसके अतिरिक्त, टैक्टेंट समाधानों के अपवर्तक सूचकांकों में अंतर के कारण ऑप्टिकल कलाकृतियों को कैल्शियम-असंवेदनशील संकेतक (tdTomato) के साथ-साथ कैल्शियम संकेतक (GCaMP6)11शुरू करने वाले अनुपातमेट्रिक विश्लेषण द्वारा कम किया गया था। इस डिजाइन ने तरल चैनलों के बीच अचानक स्विचिंग के साथ वीवो में स्वाद कोशिकाओं की सूक्ष्म स्थिरता प्रदान की। नतीजतन, μTongue वीवो मेंमाउस स्वाद कलियों के लिए कई टैंट्स की एक विश्वसनीय कार्यात्मक स्क्रीनिंग को लागू करता है।
इस प्रोटोकॉल में, प्रायोगिक प्रक्रियाओं को μTongue का उपयोग करके वीवो में माउस कवकरूप स्वाद कलियों के कैल्शियम इमेजिंग के लिए विस्तार से समझाया जाता है। सबसे पहले, कृत्रिम लार और टैस्टेंट समाधान तैयार करने का वर्णन किया गया है। दूसरा, अर्ध-स्थिर-राज्य प्रवाह को प्राप्त करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली की स्थापना शुरू की गई है । तीसरा, छवि अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए μTongue पर माउस जीभ माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं चित्रित कर रहे हैं । अंत में, पार्श्व गति कलाकृतियों और अनुपात धातु के सुधार सहित छवि विश्लेषण के लिए प्रत्येक कदम, निर्दिष्ट है । इस प्रोटोकॉल को माउस सुविधा और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप या समकक्ष उपकरण के साथ किसी भी शोध प्रयोगशाला में आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित वीवो मेंस्वाद कोशिकाओं की कार्यात्मक गतिविधियों की जांच के लिए μTongue लागू करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कोरिया सरकार (एमएसआईटी) (नहीं) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) ग्रांट इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक साइंस (आईबीएस-आर015-डी1) ने समर्थन दिया । 2019M3A9E2061789), और कोरिया सरकार (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) अनुदान द्वारा। हम यूनू किम और यूजीन ली की तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं ।
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
Riferimenti
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
