पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा माइकोबैक्टीरिया की लिपिड संरचना का विश्लेषण
Summary
माइकोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला की सेल दीवार की कुल लिपिड सामग्री निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के माइकोलिक एसिड के निष्कर्षण और विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल दिखाए जाते हैं। इन माइकोबैक्टीरियल यौगिकों की निगरानी के लिए एक पतली परत क्रोमेटोग्राफिक प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है।
Abstract
माइकोबैक्टीरिया प्रजातियां विकास की दर, पिगमेंटेशन की उपस्थिति, ठोस मीडिया पर प्रदर्शित कॉलोनी आकृति विज्ञान, साथ ही अन्य फेनोटाइपिक विशेषताओं में एक-दूसरे से भिन्न हो सकती हैं। हालांकि, वे सभी आम में माइकोबैक्टीरिया के सबसे प्रासंगिक चरित्र हैं: इसकी अनूठी और अत्यधिक हाइड्रोफोबिक सेल दीवार। माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों में झिल्ली-सहसंयोजक लिंक्ड कॉम्प्लेक्स होता है जिसमें अरबिनोगालेक्टन, पेप्टिडोग्लाइकन और माइकोलिक एसिड की लंबी श्रृंखला शामिल होती है, जो माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों के बीच भिन्न होती है। इसके अतिरिक्त, माइकोबैक्टीरिया लिपिड का उत्पादन भी कर सकता है जो उनकी कोशिका सतहों पर स्थित हैं, गैर-सहसंयोजक रूप से जुड़े हुए हैं, जैसे कि फथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट (पीडीआईएम), फिनोलिक ग्लाइकोक्लिपिड्स (पीजीएल), ग्लाइकोपेप्टिडोक्लिपिड्स (जीपीएल), अकिल्ट्रेहलोस (एए) या फोस्फेटिडिल-इनोसिटॉल मैनसाइडो (पीआईएसएम), दूसरों के बीच। उनमें से कुछ को रोगजनक माइकोबैक्टीरिया में उग्रता कारक माना जाता है, या मेजबान-माइकोबैक्टीरिया इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण एंटीजेनिक लिपिड। इन कारणों से, कई क्षेत्रों में उनके आवेदन के कारण माइकोबैक्टीरियल लिपिड के अध्ययन में महत्वपूर्ण रुचि है, माइकोबैक्टीरिया संक्रमणों की रोगजनकता में उनकी भूमिका को समझने से, संक्रामक रोगों और कैंसर जैसी अन्य विकृतियों के उपचार के लिए इम्यूनोमोडुलेटरी एजेंटों के रूप में संभावित प्रभाव तक। यहां, कुल लिपिड सामग्री को निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के मिश्रण का उपयोग करके एक ठोस माध्यम में उगाई जाने वाली माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं की माइकोलिक एसिड संरचना प्रस्तुत की जाती है। एक बार लिपिड अर्क प्राप्त हो जाने के बाद, निकाले गए यौगिकों की निगरानी के लिए पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) किया जाता है। उदाहरण प्रयोग चार अलग-अलग माइकोबैक्टीरिया के साथ किया जाता है: पर्यावरण तेजी से बढ़ते माइकोलिसिबैक्टीरियम ब्रूमे और माइकोलिसिबैक्टीरियम फोर्टुइटम, तनु धीमी गति से बढ़ते माइकोबैक्टीरियम बोविस बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी), और अवसरवादी रोगजनक तेजी से बढ़ते माइकोबैक्टीरियम फोड़ा, यह प्रदर्शित करता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल में दिखाए गए तरीकों का उपयोग माइकोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है।
Introduction
Mycobacterium एक जीनस है जिसमें रोगजनक और गैर-रोगजनक प्रजातियां शामिल हैं, जो उनके अजीब लिपिड द्वारा गठित अत्यधिक हाइड्रोफोबिक और अभेद्य कोशिका दीवार होने की विशेषता है। विशेष रूप से, माइकोबैक्टीरियल सेल वॉल में माइकोलिक एसिड होता है, जो α-alkyl और β-हाइड्रोक्सी फैटी एसिड हैं, जिसमें α-शाखा सभी माइकोलिक एसिड (लंबाई को छोड़कर) में स्थिर है और β-श्रृंखला, जिसे मेरोमायकोलेट चेन कहा जाता है, एक लंबी एलिफेटिक चेन है जिसमें साहित्य के साथ वर्णित विभिन्न कार्यात्मक रासायनिक समूह हो सकते हैं (α-, α’, मेथॉक्सी इसलिए सात प्रकार के माइकोलिक एसिड (आई-VII) का उत्पादन करते हैं, एपॉक्सी-, कार्बोक्सी-, और ω-1-मेथॉक्सी-माइकोलेट्स, इसलिए सात प्रकार के माइकोलिक एसिड का उत्पादन करते हैं1. इसके अलावा, साइबर महत्व वाले अन्य लिपिड भी माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों की सेल दीवार में मौजूद हैं। रोगजनक प्रजातियां जैसे Mycobacterium tuberculosis, तपेदिक का कारक एजेंट2 विशिष्ट लिपिड-आधारित उग्रता कारकों जैसे कि फेथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट (पीडीआईएम), फेनोलिक ग्लाइकोलिपिड (पीजीएल), डी-, त्रि-और पेंटा-एकिलट्रेहलोस (डैट, टीएटी, और पैट), या सल्फोलिपिड्स का उत्पादन करें।3. माइकोबैक्टीरियल सतह पर उनकी उपस्थिति मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने की क्षमता के साथ जुड़ी हुई है और इसलिए, मेजबान के अंदर माइकोबैक्टीरियम का विकास और दृढ़ता4. उदाहरण के लिए, ट्राइसिलग्लिसेरोल (टैग) की उपस्थिति वंश 2-बीजिंग उप-वंश के हाइपरवायरुलेंट फेनोटाइप के साथ जुड़ी हुई है M. tuberculosis, संभवतः मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने की अपनी क्षमता के कारण5,6. अन्य प्रासंगिक लिपिड तपेदिक और गैर-ट्यूबरकस माइकोबैक्टीरिया में मौजूद लिपूलिगोसाकराइड्स (एलओएस) हैं। के मामले में Mycobacterium marinum, इसकी सेल दीवार में LOSs की उपस्थिति फिसलने गतिशीलता और बायोफिल्म बनाने की क्षमता से संबंधित है और मैक्रोफेज पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता के साथ हस्तक्षेप करती है, जो मेजबान फैगोसाइट्स द्वारा बैक्टीरिया को तेज और उन्मूलन को प्रभावित करती है7,8. इसके अतिरिक्त, कुछ लिपिड की अनुपस्थिति या उपस्थिति मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करते समय उग्र या क्षीण प्रोफाइल के साथ विभिन्न मॉर्फोटाइप में वर्गीकृत होने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, किसी न किसी मॉर्फोटाइप में ग्लाइकोपिप्टिडोक्लिपिड्स (जीपीएल) की अनुपस्थिति Mycobacterium abscessus इंट्राफागोसोमल एसिडिफिकेशन को प्रेरित करने की क्षमता से जुड़ा हुआ है, और इसके परिणामस्वरूप सेल एपोप्टोसिस9, चिकनी मॉर्फोटाइप के विपरीत जो उनकी सतह में जीपीएलएस के पास होता है। इसके अलावा, माइकोबैक्टीरियल सेल वॉल की लिपिड सामग्री मेजबान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने की क्षमता से संबंधित है। यह विभिन्न विकृतियों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल को ट्रिगर करने के लिए कुछ माइकोबैक्टीरिया का उपयोग करने के संदर्भ में प्रासंगिक है10,11,12,13. उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शित किया गया है कि Mycolicibacterium vaccae, एक सैप्रोफाइटिक माइकोबैक्टीरियम, जो वर्तमान में तपेदिक के लिए इम्यूनोथेराप्यूटिक वैक्सीन के रूप में तीसरे चरण के नैदानिक परीक्षणों में है, दो औपनिवेशिक मॉर्फोटाइप प्रदर्शित करता है। जबकि चिकनी फेनोटाइप, जिसमें इसकी सतह में एक पॉलिएस्टर होता है, Th2 प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है, पॉलिएस्टर से रहित मोटा फेनोटाइप एक Th1 प्रोफ़ाइल को प्रेरित कर सकता है जब यह मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है14. माइकोबैक्टीरियल सेल में मौजूद लिपिड का प्रदर्शनों की सूची न केवल माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों पर निर्भर करती है, बल्कि माइकोबैक्टीरियल संस्कृतियों की स्थितियों पर भी निर्भर करती है: समय इनक्यूबेशन15,16 या संस्कृति माध्यम की संरचना17,18. वास्तव में, संस्कृति माध्यम संरचना में परिवर्तन एंटीट्यूमर और इम्यूनोस्टिमुलेटरी गतिविधि को प्रभावित करते हैं M. bovis बीसीजी और Mycolicibacterium brumae in vitro17. इसके अलावा, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल से शुरू M. bovis बीसीजी के खिलाफ M. tuberculosis चूहों मॉडल में चुनौती भी संस्कृति मीडिया जिसमें M. bovis बीसीजी बढ़ता है17. ये तब प्रत्येक संस्कृति स्थिति में माइकोबैक्टीरिया की लिपिड संरचना से संबंधित हो सकते हैं। इन सभी कारणों से, माइकोबैक्टीरिया की लिपिड सामग्री का अध्ययन प्रासंगिक है। माइकोबैक्टीरियल सेल दीवार की लिपिड संरचना को निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक दृश्य प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइकोबैक्टीरियल सेल दीवार से गैर-सहावता से जुड़े लिपिड यौगिकों को निकालने के लिए सोने के मानक विधि के रूप में माना जाने वाला एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। चार अलग-अलग माइकोबैक्टीरिया के निक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को स्पेन के विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालय मंत्रालय (RTI2018-098777-B-I00), फेडरर फंड्स और जनरलिट ऑफ कैटालुन्या (2017SGR-229) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सैंड्रा गुल्लार-गार्रिडो जनरलिट डी कैटालुन्या से पीएचडी कॉन्ट्रैक्ट (एफआई) की प्राप्तकर्ता हैं ।
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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