얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석
Summary
프로토콜은 광범위한 진균의 세포벽의 총 지질 함량을 추출하기 위해 제시된다. 더욱이, 진동산의 상이한 모형의 추출 및 분석 프로토콜이 도시된다. 이러한 진균 화합물을 모니터링하는 얇은 층 크로마토그래피 프로토콜도 제공됩니다.
Abstract
진균 종은 성장 속도, 색소 침착의 존재, 고체 미디어에 표시되는 식민지 형태뿐만 아니라 다른 표현성 특성에서 서로 다를 수 있습니다. 그러나, 그(것)들은 모두 일반적인 진균의 가장 관련성이 높은 특성이 있습니다: 그것의 독특하고 높게 소수성 세포 벽. 진균 종은 근균 종 간에 다른 모형을 가진 아라비노갈락탄, 펩티도글리칸 및 진골산의 긴 사슬을 포함하는 막-공유 연결된 복합체를 포함합니다. 또한, 진균은 또한 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIM), 페놀글리콜리피드(PGL), 글리코페티피피드(GPL), 아킬레알로스(AT), 또는 인플루타틸디딜(PIMos)과 같은 세포 표면에 위치하고, 비공유적으로 연결된 지질을 생산할 수 있다. 그(것)들의 몇몇은 병원성 진균에 있는 독성 요인, 또는 호스트 진균 상호 작용에 있는 중요한 항원 지질으로 간주됩니다. 이러한 이유로, 여러 분야에서 그들의 응용 으로 인해 진균 지질의 연구에 상당한 관심이 있다, 진균 감염의 병원성에서 그들의 역할을 이해에서, 감염성 질환 및 암 등 다른 병원성 치료에 대 한 면역 조절 에이전트로 가능한 의미에. 여기서, 유기 용매의 혼합물을 사용하여 고체 배지에서 자란 진균 세포의 총 지질 함량 및 진균산 조성물을 추출 및 분석하는 간단한 접근법이 제시된다. 지질 추출물이 얻어지면, 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 추출된 화합물을 모니터링하기 위해 수행됩니다. 예실험은 네 가지 다른 진균으로 수행된다: 환경 빠르게 성장하는 미콜리시박테리움 브루마와 미콜리박테리움 fortuitum, 감쇠된 천천히 성장하는 진균 보비스 균균 칼레트-게린(BCG)과 기회성 병원균이 빠르게 성장하는 진균 농양, 현재 의정서에 나타난 방법이 광범위한 진균균에 사용될 수 있음을 입증한다.
Introduction
Mycobacterium 병원성 및 비병원성 종을 구성하는 속으로, 특유의 지질에 의해 형성된 높은 소수성 및 불투과성 세포벽을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 균균 세포벽에는 α 알킬과 β 하이드록시 지방산인 진동산이 포함되어 있으며, α 분지는 모든 진동산(길이 제외)과 β 사슬에서 상수이며, 메로미콜레이트 체인이라고 불리는 β 체인은 문헌과 함께 설명된 다른 기능성 화학적 집단을 함유할 수 있는 긴 알리파성 체인(me-α α, α θ-, 에폭시, 카박스시 및 ω-1-메톡시-골곱, 따라서 골수산의 7가지 유형(I-VII)을 생성합니다.1. 더욱이, 의심할 여지없는 중요성을 가진 그밖 지질은 또한 진균 종의 세포 벽에 존재합니다. 병원성 종과 같은 Mycobacterium tuberculosis, 결핵의 원인 에이전트2 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIMs), 페놀 글리콜리피드(PGL), 디-, 트라이-및 펜타-아실트레할로스(DAT, TAT 및 PAT) 또는 설폴리피드 와 같은 특정 지질 기반 독성 요인을 생성합니다.3. 진균 표면에 그들의 존재는 호스트 면역 반응을 수정하는 기능과 연관되었습니다, 따라서, 호스트 내부진균의 진화와 지속성4. 예를 들어, 트리아실글리세롤(TAG)의 존재는 계보 2-베이징 하위 혈통의 초연한 표현형과 관련이 있다. M. tuberculosis, 아마도 호스트 면역 반응을 감쇠하는 그것의 능력 때문에5,6. 다른 관련 지질은 결핵 과 비 결핵 진균에 존재하는 lipooligosaccharides (LOSs)입니다. Mycobacterium marinum, 세포벽에 LOS의 존재는 미닫이 운동성 및 생물막형성 능력과 관련이 있으며 대식세포 패턴 인식 수용체에 의한 인식을 방해하여 숙주 식세포에 의한 박테리아의 섭취및 제거에 영향을 미치는 영향7,8. 추가적으로, 몇몇 지질의 부재 또는 존재는 호스트 세포와 상호 작용할 때 악성 또는 감쇠 단면도를 가진 상이한 형태형으로 분류될 수 있습니다. 예를 들어, 글리코펜티오닙스(GPL)의 거친 형태에 Mycobacterium abscessus 인트라고소말 산성화를 유도하는 능력과 관련이 있으며, 결과적으로 세포 세포화증9, 자신의 표면에 GPL을 소유 하는 부드러운 형태와는 달리. 더욱이, 진균세포벽의 지질 함량은 숙주에서 면역 반응을 수정하는 능력과 관련이 있다. 이것은 다른 병리학에 대하여 보호 면역 단면도를 시작하기 위하여 몇몇 진균을 사용하는 맥락에서 관련있습니다10,11,12,13. 예를 들어, Mycolicibacterium vaccae, 결핵에 대한 면역 치료 백신으로 현재 III 임상 시험 단계에 있는 사프로피틱 진균균은 두 개의 식민지 형태형을 표시합니다. 표면에 폴리에스테르를 함유한 부드러운 표현형이 Th2 반응을 유발하는 반면, 폴리에스테르의 거친 표현형 변형은 숙주 면역 세포와 상호 작용할 때 Th1 프로파일을 유도할 수 있습니다.14. 진균 세포에 존재하는 지질의 레퍼토리는 진균 종뿐만 아니라 진균 배양의 조건에 따라 달라집니다 : 잠복기의 시간15,16 배양 배지의 조성17,18. 사실, 배양 배지 조성물의 변화는 항종양 및 면역 자극 활성에 영향을 미칩니다. M. bovis BCG 및 Mycolicibacterium brumae in vitro17. 더욱이, 보호 면역 프로파일에 의해 트리거 M. bovis 에 대한 BCG M. tuberculosis 마우스 모델의 도전은 또한 배양 매체에 달려 있습니다. M. bovis BCG성장17. 이들은 그 때 각 문화 조건에서 진균의 지질 조성과 관련될 수 있었습니다. 이러한 모든 이유로, 진균의 지질 함량에 대한 연구는 관련이 있습니다. 근균 세포벽의 지질 조성물을 추출하고 분석하는 시각적 절차가 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골균 세포벽으로부터 비연하 로 연결된 지질 화합물의 추출을 위한 금표준 방법으로 간주되는 간단한 프로토콜이 제시된다. 4개의 상이한 진균균의 추출된 지질으로부터 1차원 및 2차원 TCC에 의한 추가 시각화가 도시된다.
클로로폼과 메탄올의 2연연속 결합 혼합물은 균균 세포의 립액함량을 회수하는 데 가장 널리 사용되는 용매혼합물(23,<sup class="x…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 과학, 혁신 및 대학의 스페인 부에 의해 투자되었다 (RTI2018-098777-B-I00), 페더 펀드, 그리고 카탈루냐의 일반 (2017SGR-229). 산드라 과라-가리도는 일반타트 드 카탈루냐에서 박사 학위 계약(FI)을 받고 있습니다.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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