İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi
Summary
Çok çeşitli mikobakterilerin hücre duvarının toplam lipit içeriğini çıkarmak için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, farklı mikolik asit türlerinin ekstraksiyon ve analitik protokolleri gösterilmiştir. Bu mikobakteriyel bileşikleri izlemek için ince katmanlı bir kromatografik protokol de sağlanmaktadır.
Abstract
Mikobakteri türleri büyüme hızında, pigmentasyon varlığında, katı medyada görüntülenen koloni morfolojisinde ve diğer fenotipik özelliklerde birbirinden farklı olabilir. Bununla birlikte, hepsi mikobakterilerin en alakalı karakterine sahiptir: benzersiz ve son derece hidrofobik hücre duvarı. Mikobakteri türleri, mikobakteri türleri arasında farklılık gösteren türlere sahip arabinogalactan, peptidoglikan ve uzun mikolik asit zincirlerini içeren membran-kovalent bağlantılı bir kompleks içerir. Ek olarak, mikobakteriler ayrıca bulunan lipitleri de üretebilir, phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipidler (PGL), glikoptidolipidler (GPL), acyltrehaloses (AT) veya fosfatidil-inositol mannosides (PIM) gibi hücre yüzeylerinde, yaygın olarak bağlı değildir. Bazıları patojenik mikobakterilerde virülans faktörleri veya konak-mikobakteri etkileşiminde kritik antijenik lipitler olarak kabul edilir. Bu nedenlerle mikobakteriyel lipitlerin mikobakteri enfeksiyonlarının patojenikliğindeki rollerini anlamalarından, bulaşıcı hastalıkların ve kanser gibi diğer patolojilerin tedavisinde immünomodülatör ajanlar olarak olası bir imaya kadar çeşitli alanlarda uygulanması nedeniyle incelenmesine önemli bir ilgi vardır. Burada, organik çözücülerin karışımları kullanılarak katı bir ortamda yetiştirilen mikobakteri hücrelerinin toplam lipit içeriğini ve mikolik asit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için basit bir yaklaşım sunulmaktadır. Lipit özleri elde edildikten sonra, çıkarılan bileşikleri izlemek için ince tabaka kromatografisi (TLC) yapılır. Örnek deney dört farklı mikobakteri ile gerçekleştirilir: çevresel hızlı büyüyen Mycolicibacterium brumae ve Mycolicibacterium fortuitum, zayıflamış yavaş büyüyen Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ve fırsatçı patojen hızlı büyüyen Mycobacterium apsesi, mevcut protokolde gösterilen yöntemlerin çok çeşitli mikobakteriler için kullanılabileceğini göstermiştir.
Introduction
Mycobacterium patojenik ve patojenik olmayan türlerden oluşan bir cinstir, kendine özgü lipitleri tarafından oluşturulan son derece hidrofobik ve geçirimsiz bir hücre duvarına sahip olması ile karakterizedir. Özellikle, mikobakteri hücre duvarı mikolik asitler içerir, tüm mikolik asitlerde (uzunluk hariç) α dalının sabit olduğu α-alkil ve β-hidroksi yağ asitleri olan ve meromycolate zinciri olarak adlandırılan β zinciri, literatürle birlikte tanımlanan farklı fonksiyonel kimyasal grupları içerebilen uzun bir alifatik zincirdir (α, α’, metoksi-, φ-, epoksi-, karboksi-ve ω-1-metoksi- mikolatlar), bu nedenle yedi tür mikolik asit üretir (I-VII)1. Ayrıca, mikobakteri türlerinin hücre duvarında tartışmasız öneme sahip diğer lipitler de mevcuttur. Patojenik türler gibi Mycobacterium tuberculosis, tüberkülozun etken maddesi2 phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipid (PGL), di,tri-ve penta-acyltrehaloses (DAT, TAT ve PAT) veya sulfolipids gibi spesifik lipid bazlı virülans faktörleri üretir3. Mikobakteri yüzeyindeki varlıkları, konak immün yanıtı değiştirme yeteneği ve bu nedenle konakçı içindeki mikobakterinin evrimi ve kalıcılığı ile ilişkilendirilmiştir.4. Örneğin, triacylglycerols (TAG) varlığı Lineage 2-Pekin alt soy hipervirulent fenotip ile ilişkilendirilmiştir M. tuberculosis, muhtemelen konak bağışıklık tepkisini zayıflatıcı kapasitesi nedeniyle5,6. Diğer ilgili lipitler tüberküloz ve nontuberculous mikobakterilerde bulunan lipooligosaccharides (LOSs) ‘dir. Durumunda Mycobacterium marinum, HÜCRE DUVARINDA LOSS’un varlığı sürgü hareketliliği ve biyofilm oluşturma yeteneği ile ilgilidir ve makrofaj örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınmasına müdahale eder, konak fagositler tarafından bakterilerin alımını ve yok olmasını etkiler7,8. Ek olarak, bazı lipitlerin yokluğu veya varlığı, aynı türün üyelerinin konak hücrelerle etkileşime girerken virülan veya zayıf profillere sahip farklı morfotipler halinde sınıflandırılmasına izin verir. Örneğin, kaba morfotipinde glikopeptidolipidlerin (GPL) bulunmaması Mycobacterium abscessus intrafagozomal asitleşmeye ve dolayısıyla hücre apoptozuna neden olma yeteneği ile ilişkilendirilmiştir.9, yüzeylerinde GPL’lere sahip pürüzsüz morfotipin aksine. Ayrıca, mikobakteri hücre duvarının lipit içeriği konakçıda immün yanıtı değiştirme yeteneği ile ilgilidir. Bu, farklı patolojilere karşı koruyucu bir bağışıklık profilini tetiklemek için bazı mikobakterilerin kullanılması bağlamında geçerlidir.10,11,12,13. Örneğin, Mycolicibacterium vaccae, şu anda tüberküloz için immünoterapik bir aşı olarak faz III klinik çalışmalarda bulunan bir saprofitik mikobakteri, iki kolonyal morfotip gösterir. Yüzeyinde bir polyester içeren pürüzsüz fenotip bir Th2 yanıtını tetiklerken, polyesterden yoksun kaba fenotip, konak bağışıklık hücreleriyle etkileşime girdiğinde bir Th1 profiline neden olabilir.14. Mikobakteri hücresinde bulunan lipitlerin repertuarı sadece mikobakteri türlerine değil, aynı zamanda mikobakteri kültürlerinin koşullarına da bağlıdır: kuluçka zamanı15,16 veya kültür ortamının bileşimi17,18. Aslında, kültür orta bileşimindeki değişiklikler antitümör ve immünostimülatör aktivitesini etkiler. M. bovis BCG ve Mycolicibacterium brumae in vitro17. Ayrıca, tarafından tetiklenen koruyucu bağışıklık profili M. bovis BCG karşı M. tuberculosis fare modellerinde meydan okuma, aynı zamanda M. bovis BCG büyüyor17. Bunlar daha sonra her kültür durumunda mikobakterilerin lipid bileşimi ile ilgili olabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı, mikobakterilerin lipit içeriğinin incelenmesi önemlidir. Mikobakteri hücre duvarının lipit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için görsel bir prosedür sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikobakteri hücre duvarından yaygın olarak bağlı olmayan lipit bileşiklerinin çıkarılması için altın standart yöntem olarak kabul edilen basit bir protokol sunulmuştur. Dört farklı mikobakterinin çıkarılan lipitlerinden bir ve iki boyutlu TLC’ler tarafından daha fazla görselleştirme gösterilmiştir.
Mikobakteri hücrelerinin lipidik içeriğini kurtarmak için art arda iki kombine kloroform ve metanol karışımı en yaygın kullanılan çözücü karışımıdır<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Fonları ve Catalunya Generalitat (2017SGR-229) tarafından finanse edildi. Sandra Guallar-Garrido, Generalitat de Catalunya’dan bir doktora sözleşmesinin (FI) sahibidir.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
Riferimenti
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
