Summary

الحصاد والتصنيف: خطوة مهملة في أبحاث أساليب البيوفيلم

Published: April 22, 2022
doi:

Summary

تفصل هذه الورقة الطرق التي توضح ثلاث تقنيات شائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها على نوعين من الأسطح ، واختبار الصلابة لطريقة الحصاد والحد الأدنى من المعلومات التي يجب مراعاتها عند اختيار وتحسين تقنيات الحصاد والتصنيف لزيادة قابلية التكاثر.

Abstract

تتكون طرق البيوفيلم من أربع خطوات متميزة: زراعة البيوفيلم في نموذج ذي صلة ، ومعالجة البيوفيلم الناضج ، وحصاد البيوفيلم من السطح وتصنيف الكتل ، وتحليل العينة. من بين الخطوات الأربع ، يعد الحصاد والتصنيف الأقل دراسة ولكنه مع ذلك حاسم عند النظر في إمكانية التحيز في الاختبار. توضح هذه المقالة تقنيات الحصاد والتصنيف الشائعة الاستخدام للأغشية الحيوية المزروعة على ثلاثة أسطح مختلفة. وتشمل تقنيات حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية الثلاثة، المستقاة من مراجعة واسعة النطاق للأدبيات، الدوامة والصوتنة، والكشط والتجانس، والكشط والدوامة والصوتنة. يتم النظر في نوعين من الأسطح: الصلبة غير المسامية (زجاج البولي والبورسليكات) والمسامية (السيليكون). بالإضافة إلى ذلك ، نقدم توصيات للحد الأدنى من المعلومات التي يجب تضمينها عند الإبلاغ عن تقنية الحصاد المتبعة وطريقة مصاحبة للتحقق من التحيز.

Introduction

وقد تطور تعريف الأغشية الحيوية على مدى العقود القليلة الماضية ويشمل الارتباط الميكروبي مع مجموعة متنوعة من الأسطح البيولوجية و/أو غير البيولوجية، وإدراج المكونات غير الخلوية1 التي تظهر نموا مختلفا وتعبيرا جينيا2 داخل مصفوفة. يوفر البيوفيلم الحماية من الضغوط البيئية مثل التجفيف وقد يجعل عمل المطهرات الكيميائية أقل فعالية مما يؤدي إلى بقاء الميكروبات. يمكن للناجين داخل الفيلم الحيوي أن يوفروا مصدرا للكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض التي تشكل مصدر قلق للصحة العامة3.

تتكون طرق الأغشية الحيوية من أربع خطوات ، النمو ، العلاج ، أخذ العينات (الحصاد والتصنيف) ، والتحليل. النمو ، الخطوة الأولى ، حيث يحدد المستخدم ظروف نمو الكائن الحي ، ودرجة الحرارة ، والوسائط ، وما إلى ذلك ، هو الأكثر مراعاة والإبلاغ عنه في أدبيات البيوفيلم4،5،6،7. تقوم خطوة العلاج بتقييم مضادات الميكروبات (مثل المطهرات) لتحديد فعاليتها إما ضد الأغشية الحيوية الناضجة3،8،9 أو يمكن دمج مضادات الميكروبات في السطح لتحديد قدرة المنتج على منع أو تقليل نمو الأغشية الحيوية10. تتضمن الخطوة الثالثة ، أخذ العينات ، خطوات لحصاد البيوفيلم من السطح الذي كان ينمو عليه وتصنيف الكتل التي تمت إزالتها3،8،11. قد تتضمن الخطوة الرابعة ، التحليل ، تعداد الخلايا القابلة للحياة ، والفحص المجهري ، وقياسات التألق ، والنتائج الجزيئية ، و / أو تقييم مكون المصفوفة8,9. يوفر تقييم البيانات معلومات حول نتائج التجربة. ومن بين الخطوات الأربعة، غالبا ما يكون أخذ العينات هو الخطوة الأكثر تجاهلا لأنه يفترض أن تقنية حصاد الأغشية الحيوية المختارة و/أو تصنيفها فعالة بنسبة 100٪، وغالبا ما تكون دون تحقق11.

تتطلب المعلقات العوالق للبكتيريا ، التي غالبا ما تعتبر متجانسة ، دوامة بسيطة قبل التحليل. ومع ذلك، فإن الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة تتكون من الكائنات الحية الدقيقة (بدائية النواة و/أو حقيقية النواة)، والسكريات الخارجية، والبروتينات، والدهون، والحمض النووي خارج الخلية، والخلايا المضيفة12. هناك حاجة إلى خطوات تتجاوز طرق الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية للعوالق من أجل حصاد الأغشية الحيوية بشكل كاف من سطح ما ثم تقسيمها إلى تعليق متجانس للخلية الواحدة. أظهر استعراض واسع النطاق للأدبيات (معلومات غير مدرجة في هذا المنشور) أن اختيار تقنية الإزالة والتصنيف يعتمد على عدد من العوامل ، بما في ذلك الأنواع الموجودة في البيوفيلم ، والسطح الذي يرتبط به البيوفيلم (غير مسامي أو مسامي) ، وإمكانية الوصول إلى أسطح النمو (قسيمة قابلة للإزالة بسهولة أو تدمير مادي للجهاز الذي ينمو فيه البيوفيلم) ، هندسة السطح (المساحة والشكل) ، وكثافة الأغشية الحيوية على أسطح النمو ، والمعدات المختبرية المتاحة.

عندما يتم حصاد البيوفيلم من سطح ، يكون تعليق الخلية الناتج غير متجانس. وإذا أريد تعداد هذا التعليق غير المنتظم بدقة، فيجب تصنيفه إلى خلايا فردية. تفترض أعداد الصفائح القابلة للحياة أن وحدة تشكيل المستعمرة تنشأ من بكتيريا واحدة. إذا تم وضع مجاميع من البيوفيلم على وسط النمو ، فمن المستحيل التمييز بين الخلايا الفردية التي يمكن أن تؤدي إلى تقديرات غير دقيقة. على سبيل المثال ، أثناء اختبار فعالية المطهر ، إذا كان العلاج يزيل الأغشية الحيوية بشكل فعال للغاية من سطح مقارنة بالتحكم ، فقد يظهر تقليل السجل كبيرا بشكل مصطنع مقارنة بالتحكم. من ناحية أخرى، يبدو أن المطهر الكيميائي الذي يثبت الأغشية الحيوية على سطح مقارنة بعنصر التحكم لديه انخفاض أقل في السجل11. يمكن أن يؤدي هذا النوع من السيناريوهات إلى تفسير متحيز للبيانات التجريبية.

واستعدادا للنشر، خلص استعراض للأدبيات إلى أن النهج الشائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها تشمل الكشط أو المسح أو الصوتنة أو الدوامة أو مزيج من هذه النهج. يعرف الكشط بأنه الإزالة الفيزيائية للفيلم الحيوي من الأسطح باستخدام عصا معقمة أو ملعقة أو أداة أخرى. يشير المسح إلى إزالة البيوفيلم من الأسطح باستخدام عصا قطنية مائلة أو غيرها من المواد الماصة الثابتة. يشير الصوتنة إلى تعطيل الأغشية الحيوية من الأسطح عبر الموجات فوق الصوتية الموزعة عبر الماء. يشير الدوامة إلى استخدام خلاط لتحقيق دوامة سائلة للعينة داخل أنبوب. يستخدم التجانس شفرات دوارة لقص كتل الأغشية الحيوية التي يتم حصادها في تعليق خلية واحدة. في هذه الورقة ، نقدم ثلاث طرق للحصاد والتصنيف لنوعين مختلفين من الأسطح ، صلبة / غير مسامية ومسامية.

يتم توفير قائمة بالحد الأدنى من المعلومات الموصى بها التي يجب على الباحثين تضمينها في أقسام الأساليب في المنشورات. نأمل أن يؤدي تضمين هذه المعلومات إلى تمكين الباحثين الآخرين من إعادة إنتاج عملهم. لا توجد طريقة مثالية للحصاد والتصنيف ، لذلك ، يتم أيضا تقديم توصيات حول كيفية التحقق من هذه التقنية.

يتم توضيح ثلاث طرق شائعة لحصاد وتصنيف الأغشية الحيوية من أسطح النمو الشائعة في هذه المقالة. ستمكن هذه المعلومات الباحثين من فهم الدقة والتحيز بشكل عام لطريقة اختبار الأغشية الحيوية بشكل أفضل. الطرق الموصوفة هي كما يلي: (1) يتم حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية Pseudomonas aeruginosa المزروعة على كوبونات البولي كربونات (سطح صلب غير مسامي) تحت قص عالي السوائل في مفاعل البيوفيلم CDC وتصنيفها بعد مزيج من خمس خطوات من الدوامة والصوتنة لتحقيق حصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها (2) A P. aeruginosa يتم حصاد الأغشية الحيوية المزروعة على كوبونات زجاجية البورسليكات (سطح صلب غير مسامي) في مفاعل التدفق بالتنقيط تحت قص منخفض السوائل وتصنيفها باستخدام الكشط والتجانس (3) يتم حصاد الأغشية الحيوية الإشريكية القولونية المزروعة في أنابيب السيليكون (سطح مسامي) وتصنيفها باستخدام الكشط ، تليها الصوتنة والدوامة.

Protocol

1. دوامة وصوتنة تنمو ناضجة P. aeruginosa ATCC 15442 البيوفيلم نمت وفقا لمعيار ASTM E25622. في نهاية فترة النمو 48 ساعة ، استعد لمعالجة البيوفيلم وكوبونات العينات وفقا لمعيار ASTM E28718 أدخل واقيات رذاذ معقمة معقمة في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل باستخدا…

Representative Results

التحقق من صحة / تأكيد طريقة الحصادفحصت العديد من الدراسات التي أجريت في مختبرنا قدرة الدوامة والصوتنة على حصاد الأغشية الحيوية المزروعة في مفاعل الأغشية الحيوية (ASTM E2562)2 بشكل فعال باستخدام طريقة الأنبوب الواحد (ASTM E2871)8. تم زراعة البيو?…

Discussion

الحد الأدنى من المعلومات لطرق الحصاد والتصنيف
لإنشاء بيانات بيوفيلم قابلة للتكرار عبر المجتمع العلمي ، من الضروري أن يدرج المؤلفون أكبر قدر ممكن من التفاصيل فيما يتعلق بكل خطوة من خطوات النمو والمعالجة وأخذ العينات والتحليل لطريقة البيوفيلم. وقد ساعد توحيد أساليب البيوفيلم ف?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نعرب عن تقديرنا لدانييل أور غوفيا، وبلين فريتز، وجنيفر سامرز، وفاي سان لي على مساهماتهم في هذه الورقة.

Materials

50 mL conical vials Thermo Scientific 339652
100 mL glass beakers Fisher Scientific FB102100
5 mL serological pipettes Fisher Scientific 13-678-12D For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes Fisher Scientific 13-678-14C For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks Puritan 807
Hemostats Fisher Scientific 16-100-115
Metal spatula Fisher Scientific 14-373
PTFE policemen Saint-Gobain 06369-04
S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool IKA 4446700 For homogenization of biofilm samples.
Scissors Fisher Scientific 08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French Medline Industries DYND11502
Silicone tubing, size 16 Cole-Parmer EW96400-16
Splash Guards BioSurface Technologies, Inc. CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser IKA 3737001 For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors Cole-Parmer EW02023-86
Ultrasonic Cleaner Elma TI-H15
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder Scientific Industries SI-V506

Riferimenti

  1. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
  2. ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
  3. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  4. Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
  5. Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
  6. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
  7. ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
  8. Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
  9. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
  10. Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
  11. Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
  12. ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
  13. Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
  14. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
  15. Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
  16. Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
  17. Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
  18. Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
  19. Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
  20. Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
check_url/it/62390?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Buckingham-Meyer, K., Miller, L. A., Parker, A. E., Walker, D. K., Sturman, P., Novak, I., Goeres, D. M. Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research. J. Vis. Exp. (182), e62390, doi:10.3791/62390 (2022).

View Video