Cosecha y desagregación: un paso pasado por alto en la investigación de métodos de biopelícula
Summary
Este documento detalla los métodos que demuestran tres técnicas comunes de recolección y desagregación de biopelículas en dos tipos de superficie, pruebas de robustez de un método de cosecha e información mínima a considerar al elegir y optimizar las técnicas de cosecha y desagregación para aumentar la reproducibilidad.
Abstract
Los métodos de biopelícula consisten en cuatro pasos distintos: cultivar la biopelícula en un modelo relevante, tratar la biopelícula madura, cosechar la biopelícula de la superficie y desagregar los grupos, y analizar la muestra. De los cuatro pasos, la recolección y la desagregación son los menos estudiados, pero sin embargo críticos cuando se considera el potencial de sesgo de la prueba. Este artículo demuestra las técnicas de cosecha y desagregación comúnmente utilizadas para biopelículas cultivadas en tres superficies diferentes. Las tres técnicas de recolección y desagregación de biopelículas, obtenidas de una extensa revisión de la literatura, incluyen vórtice y sonicación, raspado y homogeneización, y raspado, vórtice y sonicación. Se consideran dos tipos de superficie: dura no porosa (policarbonato y vidrio de borosilicato) y porosa (silicona). Además, proporcionamos recomendaciones para la información mínima que debe incluirse al informar la técnica de cosecha seguida y un método acompañante para verificar el sesgo.
Introduction
La definición de biofilm ha evolucionado en las últimas décadas y abarca la asociación microbiana con una variedad de superficies biológicas y/o no biológicas, la inclusión de componentes no celulares1 que muestran un crecimiento diferente y la expresión genética2 dentro de una matriz. La biopelícula proporciona protección contra las tensiones ambientales, como el secado, y puede hacer que la acción de los desinfectantes químicos sea menos efectiva, lo que resulta en la supervivencia de los microbios. Los sobrevivientes dentro de una biopelícula pueden potencialmente proporcionar una fuente de microorganismos patógenos que son un problema de salud pública3.
Los métodos de biopelícula se componen de cuatro pasos, crecimiento, tratamiento, muestreo (cosecha y desagregación) y análisis. El crecimiento, el primer paso, donde el usuario determina las condiciones de crecimiento del organismo, la temperatura, los medios, etc., es el más considerado e informado en la literatura de biofilm4,5,6,7. La etapa de tratamiento evalúa los antimicrobianos (por ejemplo, desinfectantes) para determinar su eficacia, ya sea contra una biopelícula madura3,8,9 o el antimicrobiano puede incorporarse a la superficie para determinar la capacidad del producto para prevenir o reducir el crecimiento de la biopelícula10. El tercer paso, el muestreo, incluye pasos para cosechar la biopelícula de la superficie en la que estaba creciendo y para desagregar los grupos eliminados3,8,11. El cuarto paso, el análisis, puede incluir recuentos celulares viables, microscopía, mediciones de fluorescencia, resultados moleculares y/o una evaluación de componentes matriciales8,9. La evaluación de los datos proporciona información sobre el resultado de un experimento. De los cuatro, el muestreo es a menudo el paso más pasado por alto porque supone que la técnica de recolección y/o desagregación de biopelícula elegida es 100% efectiva, a menudo sin verificación11.
Las suspensiones planctónicas de bacterias, a menudo consideradas homogéneas, requieren un vórtice simple antes del análisis. Los biofilms, sin embargo, son comunidades complejas compuestas por microorganismos (procariotas y/o eucariotas), exopolisacáridos, proteínas, lípidos, ADN extracelular y células huésped12. Se necesitan pasos más allá de los métodos tradicionales de cultivo microbiológico planctónico para cosechar adecuadamente la biopelícula de una superficie y luego desagregarla en una suspensión homogénea de una sola célula. Una extensa revisión de la literatura (información no incluida en esta publicación) demostró que la elección de la técnica de eliminación y desagregación depende de una serie de factores, incluidas las especies presentes en la biopelícula, la superficie a la que está unida la biopelícula (no porosa o porosa), la accesibilidad a las superficies de crecimiento (cupón fácilmente extraíble o destrucción física del aparato en el que crece la biopelícula), geometría de la superficie (área y forma), densidad de la biopelícula en las superficies de crecimiento y equipo de laboratorio disponible.
Cuando la biopelícula se cosecha de una superficie, la suspensión celular resultante es heterogénea. Para que esta suspensión no uniforme se enumere con precisión, debe desglosarse en células individuales. Los recuentos de placas viables suponen que una unidad formadora de colonias se origina en una bacteria. Si se colocan agregados de biopelícula en el medio de crecimiento, es imposible distinguir células individuales, lo que podría conducir a estimaciones inexactas. Por ejemplo, durante las pruebas de eficacia del desinfectante, si un tratamiento elimina la biopelícula de manera muy efectiva de una superficie en comparación con el control, la reducción del registro podría parecer artificialmente grande en comparación con el control. Por otro lado, un desinfectante químico que fija biofilm en una superficie en comparación con el control parecerá tener una menor reducción de logaritmos11. Este tipo de escenario podría conducir a una interpretación sesgada de los datos experimentales.
En preparación para la publicación, una revisión de la literatura determinó que los enfoques comunes para cosechar y desagregar la biopelícula incluyen raspado, hisopo, sonicación, vórtice o una combinación de estos. El raspado se define como la eliminación física de la biopelícula de las superficies con un palo estéril, espátula u otra herramienta. El hisopo se refiere a la eliminación de la biopelícula de las superficies con un palo con punta de algodón u otro material absorbente fijo. La sonicación se refiere a la interrupción de la biopelícula de las superficies a través de ondas ultrasónicas distribuidas a través del agua. El vórtice se refiere al uso de un mezclador para lograr un vórtice líquido de la muestra dentro de un tubo. La homogeneización utiliza cuchillas giratorias para cortar por cizallamientos de biopelícula cosechados en una suspensión de una sola célula. En este trabajo, presentamos tres métodos de cosecha y desagregación para dos tipos de superficie diferentes, duro / no poroso y poroso.
Se proporciona una lista de información mínima recomendada que los investigadores deben incluir en las secciones de métodos de las publicaciones. Esperamos que la inclusión de esta información permita a otros investigadores reproducir su trabajo. No existe un método perfecto de cosecha y desagregación, por lo tanto, también se proporcionan recomendaciones sobre cómo verificar la técnica.
En este artículo se demuestran tres métodos comunes para cosechar y desagregar la biopelícula de las superficies de crecimiento comunes. Esta información permitirá a los investigadores comprender mejor la precisión general y el sesgo de un método de prueba de biopelícula. Los métodos descritos son los siguientes: (1) Una biopelícula de Pseudomonas aeruginosa cultivada en cupones de policarbonato (superficie dura no porosa) bajo alto cizallamiento de fluidos en el reactor de biopelícula CDC se cosecha y desagrega después de una combinación de cinco pasos de vórtice y sonicación para lograr la cosecha y desagregación de biopelícula (2) A P. aeruginosa La biopelícula cultivada en cupones de vidrio de borosilicato (superficie dura no porosa) en el reactor de flujo de goteo bajo cizallamiento de fluido se cosecha y desagrega mediante raspado y homogeneización (3) Una biopelícula de Escherichia coli cultivada en tubos de silicona (superficie porosa) se cosecha y desagrega mediante raspado, seguido de sonicación y vórtice.
Protocol
Representative Results
Discussion
Información mínima para los métodos de recolección y desagregación
Para crear datos de biopelícula reproducibles en toda la comunidad científica, es imperativo que los autores incluyan tantos detalles como sea posible con respecto a cada uno de los pasos de crecimiento, tratamiento, muestreo y análisis de un método de biopelícula. La estandarización de los métodos de biopelícula ha ayudado en este esfuerzo, ya que permite al investigador hacer referencia a un método específico y cualqui…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers y Fei San Lee por sus contribuciones a este documento.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
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