收获和分解：生物膜方法研究中被忽视的步骤
Summary
本文详细介绍了在两种表面类型上展示三种常见生物膜收获和解聚技术的方法，收获方法的坚固性测试以及在选择和优化收获和分解技术以提高可重复性时要考虑的最少信息。
Abstract
生物膜方法包括四个不同的步骤：在相关模型中生长生物膜，处理成熟的生物膜，从表面收获生物膜并分解团块，以及分析样品。在这四个步骤中，收获和分解是研究最少的，但在考虑测试偏差的可能性时仍然至关重要。本文演示了在三种不同表面上生长的生物膜的常用收获和解聚技术。从广泛的文献综述中收集的三种生物膜收获和解聚技术包括涡旋和超声处理，刮削和均质化，以及刮擦，涡旋和超声处理。考虑两种表面类型：硬质无孔（聚碳酸酯和硼硅酸盐玻璃）和多孔（硅胶）。此外，我们还提供了在报告所遵循的收获技术时应包含的最少信息的建议，以及检查偏差的随附方法。
Introduction
生物膜的定义在过去几十年中不断发展，包括微生物与各种生物和/或非生物表面的关联，包括基质中显示不同生长和遗传表达的非细胞成分12。生物膜提供保护，免受干燥等环境压力，并可能使化学消毒剂的作用效果降低，从而导致微生物的存活。生物膜中的幸存者可能会提供致病微生物的来源，这些微生物是公共卫生问题3。
生物膜方法由四个步骤组成，生长，处理，采样（收获和分解）和分析。生长是用户确定生物体生长条件、温度、培养基等的第一步，是生物膜文献4，5，6，7中考虑和报告最多的步骤。该处理步骤评估抗菌剂（例如，消毒剂）以确定其对成熟生物膜3，8，9的功效，或者可以将抗菌剂掺入表面以确定产物防止或减少生物膜生长的能力10。第三步，取样，包括从其生长的表面收获生物膜的步骤，并对去除的团块进行分类3，8，11。第四步，分析，可能包括活细胞计数，显微镜检查，荧光测量，分子结果和/或基质成分评估8，9。数据评估提供有关实验结果的信息。在这四种方法中，采样通常是最容易被忽视的步骤，因为它假定所选的生物膜收获和/或分解技术是100%有效的，通常无需验证11。
通常被认为是均质的细菌浮游悬浮液在分析之前需要简单的涡旋。然而，生物膜是由微生物（原核和/或真核）、外多糖、蛋白质、脂质、细胞外DNA和宿主细胞组成的复杂群落12。需要采取超越传统浮游微生物培养方法的步骤，以便从表面充分收获生物膜，然后将其分解成均匀的单细胞悬浮液。广泛的文献综述（本出版物中未包含的信息）表明，去除和解聚技术的选择取决于许多因素，包括生物膜中存在的物种，生物膜附着的表面（无孔或多孔），生长表面的可及性（易于去除的优惠券或生物膜生长的设备的物理破坏）， 表面几何形状（面积和形状），生长表面上生物膜的密度以及可用的实验室设备。
当从表面收获生物膜时，产生的细胞悬浮液是非均性的。如果要准确枚举这种不均匀的悬浮液，则必须将其分解为单个单元格。活板计数假设菌落形成单元来自一种细菌。如果将生物膜的聚集体放置在生长培养基上，则无法区分可能导致不准确估计的单个细胞。例如，在消毒剂功效测试期间，如果与对照组相比，处理非常有效地从表面上去除生物膜，则与对照组相比，对数减少可能显得人为地大。另一方面，与对照组相比，将生物膜固定在表面上的化学消毒剂似乎具有较低的对数减少率11。这种类型的情况可能导致对实验数据的偏见解释。
在准备出版时，对文献的回顾确定，收获和分解生物膜的常见方法包括刮擦，拭子，超声处理，涡旋或这些的组合。刮擦被定义为用无菌棒，刮刀或其他工具从表面上物理去除生物膜。擦拭是指用棉签或其他固定吸收材料从表面上去除生物膜。超声处理是指通过分布在水中的超声波破坏表面的生物膜。涡旋是指使用混合器实现管内样品的液体涡流。均质化使用旋转叶片将收获的生物膜团块剪切成单个细胞悬浮液。在本文中，我们提出了两种不同表面类型的收获和解聚方法，即硬/无孔和多孔。
提供了研究人员应在出版物的方法部分包括的建议最低限度信息清单。我们希望包含这些信息使其他研究人员能够重现他们的工作。没有完美的收获和分解方法，因此，还提供了有关如何检查该技术的建议。
本文演示了从常见生长表面收获和分解生物膜的三种常用方法。这些信息将使研究人员能够更好地了解生物膜测试方法的整体精度和偏差。描述的方法如下：（1）在CDC生物膜反应器中高流体剪切下在聚碳酸酯试样（坚硬的非多孔表面）上生长的 铜绿假单胞菌 生物膜在涡旋和超声处理的五步组合后收获和解分解，以实现生物膜收获和解聚（2）铜 绿假单胞菌 在低流体剪切作用下，在滴流反应器中硼硅酸盐玻璃试样（坚硬的非多孔表面）上生长的生物膜被收获并使用刮擦和均质化进行分解（3）在硅胶管（多孔表面）中生长 的大肠杆菌 生物膜被收获并使用刮擦分解，然后进行超声处理和涡旋。
Protocol
Representative Results
Discussion
收获和分解方法的最少信息
为了在整个科学界创建可重复的生物膜数据，作者必须尽可能多地提供有关生物膜方法的每个生长，处理，采样和分析步骤的详细信息。生物膜方法的标准化有助于这项工作，因为它允许研究人员参考特定方法和任何相关修改。然而，许多论文只包含一两句话来描述生物膜的收获和分解。为了获得更好的再现性，我们建议在出版物中包括生物膜收获的最?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Danielle Orr Goveia，Blaine Fritz，Jennifer Summers和Fei San Lee对本文的贡献。
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
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