Høst og opdeling: Et overset trin i forskning i biofilmmetoder
Summary
Dette papir beskriver metoder, der demonstrerer tre almindelige biofilmhøstnings- og opdelingsteknikker på to overfladetyper, robusthedstest af en høstmetode og minimumsinformation, der skal overvejes, når man vælger og optimerer høst- og opdelingsteknikker for at øge reproducerbarheden.
Abstract
Biofilmmetoder består af fire forskellige trin: dyrkning af biofilmen i en relevant model, behandling af den modne biofilm, høst af biofilmen fra overfladen og opdeling af klumperne og analyse af prøven. Af de fire trin er høst og opdeling de mindst undersøgte, men ikke desto mindre kritiske, når man overvejer potentialet for testbias. Denne artikel viser almindeligt anvendte høst- og opdelingsteknikker til biofilm dyrket på tre forskellige overflader. De tre biofilm høst og opdeling teknikker, hentet fra en omfattende litteratur gennemgang, omfatter hvirvel og sonikering, skrabning og homogenisering, og skrabning, hvirvel og sonikering. To overfladetyper overvejes: hårdt ikke-porøst (polycarbonat og borosilikatglas) og porøst (silikone). Derudover giver vi anbefalinger til de minimumsoplysninger, der skal medtages, når den anvendte høstteknik rapporteres, og en ledsagende metode til at kontrollere for bias.
Introduction
Definitionen af biofilm har udviklet sig i løbet af de sidste par årtier og omfatter mikrobiel tilknytning til en række biologiske og/eller ikke-biologiske overflader, herunder ikke-cellulære komponenter1, der viser forskellig vækst og genetisk ekspression2 inden for en matrix. Biofilm giver beskyttelse mod miljøbelastninger såsom tørring og kan gøre virkningen af kemiske desinfektionsmidler mindre effektiv, hvilket resulterer i mikrobernes overlevelse. De overlevende i en biofilm kan potentielt udgøre en kilde til patogene mikroorganismer, der er et folkesundhedsproblem3.
Biofilmmetoder består af fire trin, vækst, behandling, prøveudtagning (høst og opdeling) og analyse. Vækst, det første trin, hvor brugeren bestemmer organismens vækstbetingelser, temperatur, medier osv., Er det mest overvejede og rapporterede i biofilmlitteraturen4,5,6,7. Behandlingstrinnet evaluerer antimikrobielle stoffer (f.eks. desinfektionsmidler) for at bestemme deres virkning enten mod en moden biofilm3,8,9, eller det antimikrobielle stof kan inkorporeres i overfladen for at bestemme produktets evne til at forebygge eller reducere biofilmvækst10. Det tredje trin, prøveudtagning, omfatter trin til at høste biofilmen fra den overflade, hvorpå den voksede, og til at opdele de fjernede klumper3,8,11. Det fjerde trin, analysen, kan omfatte levedygtige celletal, mikroskopi, fluorescensmålinger, molekylære resultater og/eller en matrixkomponentvurdering8,9. Vurdering af data giver information om resultatet af et eksperiment. Af de fire er prøveudtagning ofte det mest oversete trin, fordi det forudsætter, at den valgte biofilmhøstnings- og/eller opdelingsteknik er 100 % effektiv, ofte uden verifikation11.
Planktoniske suspensioner af bakterier, der ofte anses for at være homogene, kræver simpel hvirvel før analyse. Biofilm er imidlertid komplekse samfund sammensat af mikroorganismer (prokaryote og / eller eukaryote), exopolysaccharider, proteiner, lipider, ekstracellulært DNA og værtsceller12. Der er behov for skridt ud over traditionelle planktoniske mikrobiologiske dyrkningsmetoder for i tilstrækkelig grad at høste biofilm fra en overflade og derefter opdele den i en homogen enkeltcellesuspension. En omfattende litteraturgennemgang (oplysninger, der ikke er medtaget i denne publikation) viste, at valget af fjernelses- og opdelingsteknik afhænger af en række faktorer, herunder arter, der er til stede i biofilmen, overflade, som biofilmen er fastgjort til (ikke-porøs eller porøs), tilgængelighed til vækstoverflader (let aftagelig kupon eller fysisk ødelæggelse af apparater, hvor biofilmen vokser), overfladegeometri (areal og form), tæthed af biofilm på vækstoverflader og tilgængeligt laboratorieudstyr.
Når biofilm høstes fra en overflade, er den resulterende cellesuspension heterogen. Hvis denne uensartede suspension skal opregnes nøjagtigt, skal den opdeles i individuelle celler. Levedygtige pladetællinger antager, at en kolonidannende enhed stammer fra en bakterie. Hvis der placeres aggregater af biofilm på vækstmediet, er det umuligt at skelne mellem individuelle celler, hvilket kan føre til unøjagtige skøn. For eksempel, under desinfektionsmiddeleffektivitetstest, hvis en behandling fjerner biofilm meget effektivt fra en overflade sammenlignet med kontrollen, kan logreduktionen forekomme kunstigt stor sammenlignet med kontrollen. På den anden side vil et kemisk desinfektionsmiddel, der fastgør biofilm på en overflade sammenlignet med kontrollen, synes at have en lavere logreduktion11. Denne type scenarie kan føre til forudindtaget fortolkning af eksperimentelle data.
Som forberedelse til offentliggørelsen fastslog en gennemgang af litteraturen, at fælles tilgange til høst og opdeling af biofilm omfatter skrabning, podning, sonikering, hvirvel eller en kombination af disse. Skrabning defineres som fysisk fjernelse af biofilm fra overflader med en steril pind, spatel eller andet værktøj. Swabbing refererer til fjernelse af biofilm fra overflader med en bomuldstippe eller andet fast absorberende materiale. Sonikering refererer til forstyrrelse af biofilm fra overflader via ultralydbølger fordelt gennem vand. Vortexing refererer til brugen af en mixer for at opnå en flydende hvirvel af prøven inde i et rør. Homogenisering bruger roterende knive til at forskyde høstede biofilmklumper i en enkeltcellesuspension. I denne artikel præsenterer vi tre høst- og opdelingsmetoder for to forskellige overfladetyper, hårde/ikke-porøse og porøse.
Der findes en liste over anbefalede minimumsoplysninger, som forskere bør medtage i publikationens metodeafsnit. Vi håber, at inddragelse af disse oplysninger gør det muligt for andre forskere at reproducere deres arbejde. Der er ingen perfekt høst- og opdelingsmetode, derfor gives der også anbefalinger til, hvordan man kontrollerer teknikken.
Tre almindelige metoder til høst og opdeling af biofilm fra almindelige vækstoverflader er demonstreret i denne artikel. Disse oplysninger vil gøre det muligt for forskere bedre at forstå den overordnede præcision og bias af en biofilm testmetode. Beskrevne metoder er som følger: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på polycarbonatkuponer (hård ikke-porøs overflade) under høj væskeforskydning i CDC Biofilm Reactor høstes og opdeles efter en femtrins kombination af hvirvel og sonikering for at opnå biofilmhøst og opdeling (2) A P. aeruginosa biofilm dyrket på borosilikatglaskuponer (hård ikke-porøs overflade) i drypstrømsreaktoren under lav væskeforskydning høstes og opdeles ved hjælp af skrabning og homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm dyrket i silikonerør (porøs overflade) høstes og opdeles ved hjælp af skrabning efterfulgt af sonikering og hvirvel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minimumsoplysninger for høst- og opdelingsmetoder
For at skabe reproducerbare biofilmdata på tværs af det videnskabelige samfund er det bydende nødvendigt, at forfattere inkluderer så mange detaljer som muligt om hvert af vækst-, behandlings-, prøveudtagnings- og analysetrinnene i en biofilmmetode. Standardiseringen af biofilmmetoder har hjulpet i denne bestræbelse, da det giver forskeren mulighed for at henvise til en bestemt metode og eventuelle relevante ændringer. Imidlertid indeholder ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers og Fei San Lee for deres bidrag til denne artikel.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
