קציר ופיזור: צעד מתעלם במחקר שיטות ביופילם
Summary
מאמר זה מפרט שיטות הממחישות שלוש טכניקות נפוצות של קצירת ביופילם ופירוק חומרים על שני סוגי משטחים, בדיקות מחוספסות של שיטת קציר ומידע מינימלי שיש לקחת בחשבון בעת בחירה ואופטימיזציה של טכניקות קצירה ופירוק כדי להגביר את הרבייה.
Abstract
שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים נפרדים: גידול הביופילם במודל רלוונטי, טיפול בביופילם הבוגר, קצירת הביופילם מפני השטח ופירוק הגושים וניתוח המדגם. מבין ארבעת השלבים, קצירה ופירוק הם הפחות נחקרים אך בכל זאת קריטיים כאשר בוחנים את הפוטנציאל להטיית מבחן. מאמר זה מדגים טכניקות קציר ופירוק נפוץ עבור biofilm גדל על שלושה משטחים שונים. שלוש טכניקות קצירת הביופילם והפירוק, שלקטו מסקירת ספרות נרחבת, כוללות מערבולת ו sonication, גירוד והומוגניזציה, ושפשוף, מערבולת ו sonication. שני סוגי משטח נחשבים: קשה לא נקבובי (פוליקרבונט וזכוכית borosilicate) ונקבובי (סיליקון). בנוסף, אנו מספקים המלצות למידע המינימלי שיש לכלול בעת דיווח על טכניקת הקציר ואחריה ושיטה נלווית לבדיקת הטיה.
Introduction
ההגדרה של ביופילם התפתחה בעשורים האחרונים וכוללת קשר מיקרוביאלי עם מגוון משטחים ביולוגיים ו/או לא ביולוגיים, הכללת רכיבים נוצרליים1 המציגים צמיחה שונה וביטוי גנטי2 בתוך מטריצה. Biofilm מספק הגנה מפני לחצים סביבתיים כגון ייבוש ועשוי להפוך את הפעולה של חומרי חיטוי כימיים פחות יעיל וכתוצאה מכך ההישרדות של חיידקים. הניצולים בתוך ביופילם יכולים לספק מקור למיקרואורגניזמים פתוגניים המהווים דאגה לבריאות הציבור3.
שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים, צמיחה, טיפול, דגימה (קצירה ופירוק) וניתוח. צמיחה, הצעד הראשון, שבו המשתמש קובע את תנאי הצמיחה האורגניזם, טמפרטורה, מדיה, וכו ‘, הוא הנחשב ביותר ודווח על בספרות biofilm4,5,6,7. שלב הטיפול מעריך מיקרוביאלים (למשל, חומרי חיטוי) כדי לקבוע את יעילותם או נגד biofilm בוגר3,8,9 או מיקרוביאלית עשוי להיות משולב לתוך פני השטח כדי לקבוע את היכולת של המוצר למנוע או להפחית את הצמיחה biofilm10. השלב השלישי, דגימה, כולל צעדים לקצור את הביופילם מפני השטח שעליהם הוא גדל ולפרק את הגושים שהוסרו 3,8,11. השלב הרביעי, ניתוח, עשוי לכלול ספירת תאים בת קיימא, מיקרוסקופיה, מדידות פלואורסצנטיות, תוצאות מולקולריות ו/או הערכת רכיב מטריצה8,9. הערכת נתונים מספקת מידע על התוצאה של ניסוי. מבין הארבעה, דגימה היא לעתים קרובות הצעד המתעלמים ביותר מכיוון שהיא מניחה שטכניקת קצירת הביופילם ו/או הפירוק הנבחרת יעילה ב-100%, לעתים קרובות ללא אימות11.
השעיות פלנקטוניות של חיידקים, הנחשבות לעתים קרובות הומוגניות, דורשות מערבולת פשוטה לפני הניתוח. ביופילמים, לעומת זאת, הם קהילות מורכבות המורכבות ממיקרואורגניזמים (פרוקריוטים ו/או אואוקריוטים), אקסופוליסכרידים, חלבונים, שומנים, דנ”א חוץ-תאי ותאים מארחים12. צעדים מעבר לשיטות התרבות המיקרוביולוגיות הפלנקטוניות המסורתיות נדרשים על מנת לקצור כראוי ביופילם מפני השטח ולאחר מכן לפרק אותו לתוך השעיה הומוגנית של תא יחיד. סקירת ספרות מקיפה (מידע שאינו כלול בפרסום זה) הראתה כי הבחירה בטכניקת ההסרה וההתפרקות תלויה במספר גורמים, כולל מינים הנמצאים בביופילם, משטח שהביופילם מחובר אליו (לא נקבובי או נקבובי), נגישות למשטחי צמיחה (קופון נשלף בקלות או הרס פיזי של המנגנון שבו הביופילם גדל), גיאומטריה על פני השטח (שטח וצורה), צפיפות של ביופילם על משטחי צמיחה, וציוד מעבדה זמין.
כאשר ביופילם נקצר מפני השטח, ההשעיה התאית המתקבלת היא הטרוגנית. אם יש לספור במדויק את ההשעיה הלא-יוניפורמית הזו, יש לפרק אותה לתאים בודדים. ספירת לוחות קיימא מניחה שיחידת הרכבת מושבה מקורה בחיידק אחד. אם אגרגטים של ביופילם ממוקמים על מדיום הצמיחה, אי אפשר להבחין בין תאים בודדים אשר יכול להוביל להערכות לא מדויקות. לדוגמה, במהלך בדיקות יעילות חיטוי, אם טיפול מסיר biofilm ביעילות רבה מפני השטח לעומת הפקד, הפחתת יומן יכול להיראות גדול באופן מלאכותי לעומת הפקד. מצד שני, חומר חיטוי כימי שמתקן ביופילם על משטח בהשוואה לבקרה ייראה כבעל הפחתת יומן נמוכה יותר11. סוג זה של תרחיש יכול להוביל לפרשנות מוטה של נתונים ניסיוניים.
לקראת הפרסום, סקירה של הספרות קבעה כי גישות נפוצות לקטיף ופירוק ביופילם כוללות גירוד, ניקוי, sonication, מערבולת או שילוב של אלה. גירוד מוגדר כהסרה פיזית של ביופילם ממשטחים עם מקל סטרילי, מרית או כלי אחר. ניקוי מתייחס להסרת ביופילם ממשטחים עם מוט כותנה או חומר סופג קבוע אחר. Sonication מתייחס שיבוש של biofilm מפני משטחים באמצעות גלים קוליים מופצים דרך מים. מערבולת מתייחסת לשימוש במיקסר כדי להשיג מערבולת נוזלית של המדגם בתוך צינור. הומוגניזציה משתמשת בלהבים מסתובבים כדי להטות גושי ביופילם שנקטפו לתוך השעיה של תא יחיד. במאמר זה, אנו מציגים שלוש שיטות קציר ופירוק עבור שני סוגי משטח שונים, קשה / לא נקבובי ונקבובי.
רשימה של מידע מינימלי מומלץ שהחוקרים צריכים לכלול בסעיפי השיטות של הפרסומים מסופקת. אנו מקווים כי הכללת מידע זה תאפשר לחוקרים אחרים לשחזר את עבודתם. אין שיטת קציר ופירוק מושלמת, ולכן, המלצות כיצד לבדוק את הטכניקה מסופקים גם.
שלוש שיטות נפוצות לקצור ולפרק ביופילם ממשטחי גדילה נפוצים מודגמות במאמר זה. מידע זה יאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את הדיוק וההטיה הכוללים של שיטת בדיקת ביופילם. השיטות המתוארות הן כדלקמן: (1) ביופילם פסאודומונס aeruginosa הגדל על קופונים פוליקרבונט (משטח קשה שאינו נקבובי) תחת גזירה נוזלית גבוהה בכור Biofilm CDC נקטף ומפוזר בעקבות שילוב של חמישה שלבים של מערבולת ו sonication כדי להשיג קציר ביופילם ופירוק (2) A P. aeruginosa ביופילם שגדל על קופונים זכוכית borosilicate (משטח קשה לא נקבובי) בכור זרימת טפטוף תחת גזירה נוזלית נמוכה נקטף ומנוטרל באמצעות גירוד והומוגניזציה (3) ביופילם קולי Escherichia גדל בצינורות סיליקון (משטח נקבובי) הוא נקצר ומפוזר באמצעות גירוד, ואחריו sonication ו מערבולת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מידע מינימלי לשיטות קצירה ופיזור
כדי ליצור נתוני ביופילם הניתנים לשחזור ברחבי הקהילה המדעית, חובה על המחברים לכלול כמה שיותר פרטים לגבי כל אחד משלבי הצמיחה, הטיפול, הדגימה והניתוח של שיטת ביופילם. התקינה של שיטות ביופילם סייעה במאמץ זה שכן היא מאפשרת לחוקר להתייחס לשיטה ספציפי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לדניאל אור גוביה, בליין פריץ, ג’ניפר סאמרס ופיי סן לי על תרומתם לעיתון זה.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
