कटाई और भेदभाव: बायोफिल्म विधियों के अनुसंधान में एक अनदेखी कदम
Summary
यह पेपर उन तरीकों का विवरण देता है जो दो सतह प्रकारों पर तीन सामान्य बायोफिल्म कटाई और भेदभाव तकनीकों को प्रदर्शित करते हैं, एक कटाई विधि का बीहड़ता परीक्षण और न्यूनतम जानकारी पर विचार करने के लिए जब कटाई और विभेदन तकनीकों को चुनने और अनुकूलित करने के लिए पुनरुत्पादन बढ़ाने के लिए।
Abstract
बायोफिल्म विधियों में चार अलग-अलग चरण होते हैं: एक प्रासंगिक मॉडल में बायोफिल्म को बढ़ाना, परिपक्व बायोफिल्म का इलाज करना, सतह से बायोफिल्म की कटाई करना और clumps को अलग करना, और नमूने का विश्लेषण करना। चार चरणों में से, कटाई और भेदभाव कम से कम अध्ययन किया जाता है लेकिन फिर भी परीक्षण पूर्वाग्रह की क्षमता पर विचार करते समय महत्वपूर्ण होता है। यह लेख तीन अलग-अलग सतहों पर उगाए गए बायोफिल्म के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कटाई और भेदभाव तकनीकों को दर्शाता है। तीन biofilm कटाई और disaggregation तकनीकों, एक व्यापक साहित्य की समीक्षा से gleaned, भंवर और sonication, स्क्रैपिंग और homogenization, और scraping, भंवर और sonication शामिल हैं। दो सतह प्रकारों पर विचार किया जाता है: हार्ड गैर-झरझरा (पॉली कार्बोनेट और बोरोसिलिकेट ग्लास) और झरझरा (सिलिकॉन)। इसके अतिरिक्त, हम न्यूनतम जानकारी के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं जिन्हें कटाई तकनीक की रिपोर्ट करते समय शामिल किया जाना चाहिए और पूर्वाग्रह की जांच करने के लिए एक साथ विधि।
Introduction
बायोफिल्म की परिभाषा पिछले कुछ दशकों में विकसित हुई है और इसमें विभिन्न प्रकार की जैविक और / या गैर-जैविक सतहों के साथ माइक्रोबियल एसोसिएशन शामिल है, जिसमें गैर-कोशिकीय घटकों को शामिल किया गया है1 जो मैट्रिक्स के भीतर अलग-अलग विकास और आनुवंशिक अभिव्यक्ति 2 प्रदर्शित करते हैं। बायोफिल्म सूखने जैसे पर्यावरणीय तनावों से सुरक्षा प्रदान करता है और रासायनिक कीटाणुनाशकों की कार्रवाई को कम प्रभावी बना सकता है जिसके परिणामस्वरूप रोगाणुओं का अस्तित्व होता है। एक बायोफिल्म के भीतर बचे लोग संभावित रूप से रोगजनक सूक्ष्मजीवों का एक स्रोत प्रदान कर सकते हैं जो एक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय हैं3।
बायोफिल्म विधियों में चार चरण शामिल हैं, विकास, उपचार, नमूनाकरण (कटाई और भेदभाव), और विश्लेषण। विकास, पहला कदम, जहां उपयोगकर्ता जीव विकास की स्थिति, तापमान, मीडिया, आदि को निर्धारित करता है, बायोफिल्म साहित्य 4,5,6,7 में सबसे अधिक माना जाता है और रिपोर्ट किया जाता है। उपचार चरण रोगाणुरोधी (जैसे, कीटाणुनाशक) का मूल्यांकन करता है ताकि उनकी प्रभावकारिता को निर्धारित किया जा सके या तो एक परिपक्व बायोफिल्म 3,8,9 के खिलाफ या रोगाणुरोधी को बायोफिल्म विकास को रोकने या कम करने के लिए उत्पाद की क्षमता निर्धारित करने के लिए सतह में शामिल किया जा सकता है। तीसरा चरण, नमूनाकरण, उस सतह से बायोफिल्म की कटाई के लिए कदम शामिल है जिस पर यह बढ़ रहा था और हटाए गए clumps3,8,11 को अलग करने के लिए। चौथा चरण, विश्लेषण, व्यवहार्य सेल गिनती, माइक्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति माप, आणविक परिणाम, और / या एक मैट्रिक्स घटक मूल्यांकन 8,9 शामिल हो सकता है। डेटा का मूल्यांकन एक प्रयोग के परिणाम के बारे में जानकारी प्रदान करता है। चार में से, नमूनाकरण अक्सर सबसे अनदेखा कदम होता है क्योंकि यह मानता है कि चुनी गई बायोफिल्म कटाई और / या भेदभाव तकनीक 100% प्रभावी है, अक्सर सत्यापन के बिना।
बैक्टीरिया के प्लवक निलंबन, जिसे अक्सर समरूप माना जाता है, को विश्लेषण से पहले सरल भंवर की आवश्यकता होती है। बायोफिल्म्स, हालांकि, सूक्ष्मजीवों (प्रोकैरियोटिक और / या यूकेरियोटिक), एक्सोपॉलीसेकेराइड्स, प्रोटीन, लिपिड, एक्स्ट्रासेल्युलर डीएनए और मेजबान कोशिकाओं से बने जटिल समुदाय हैं। पारंपरिक प्लवक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति विधियों से परे कदम उठाने के लिए पर्याप्त रूप से एक सतह से बायोफिल्म की कटाई करने के लिए आवश्यक हैं और फिर इसे एक समरूप एकल सेल निलंबन में अलग करते हैं। एक व्यापक साहित्य समीक्षा (इस प्रकाशन में शामिल नहीं जानकारी) ने प्रदर्शित किया कि हटाने और भेदभाव तकनीक का विकल्प कई कारकों पर निर्भर करता है, जिसमें बायोफिल्म में मौजूद प्रजातियां शामिल हैं, सतह जो बायोफिल्म से जुड़ी हुई है (गैर-झरझरा या झरझरा), विकास सतहों तक पहुंच (आसानी से हटाने योग्य कूपन या उपकरण का भौतिक विनाश जिसमें बायोफिल्म बढ़ रहा है), सतह ज्यामिति (क्षेत्र और आकार), विकास सतहों पर बायोफिल्म का घनत्व, और उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरण।
जब बायोफिल्म को एक सतह से काटा जाता है, तो परिणामी सेल निलंबन विषम होता है। यदि इस nonuniform निलंबन सही गणना की जा करने के लिए है, तो यह अलग-अलग कोशिकाओं में disaggregated किया जाना चाहिए। व्यवहार्य प्लेट गिनती यह मानती है कि एक कॉलोनी बनाने वाली इकाई एक जीवाणु से उत्पन्न होती है। यदि बायोफिल्म के समुच्चय को विकास माध्यम पर रखा जाता है, तो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करना असंभव है जो गलत अनुमानों को जन्म दे सकता है। उदाहरण के लिए, कीटाणुनाशक प्रभावकारिता परीक्षण के दौरान, यदि कोई उपचार नियंत्रण की तुलना में सतह से बायोफिल्म को बहुत प्रभावी ढंग से हटा देता है, तो नियंत्रण की तुलना में लॉग में कमी कृत्रिम रूप से बड़ी दिखाई दे सकती है। दूसरी ओर, एक रासायनिक कीटाणुनाशक जो नियंत्रण की तुलना में एक सतह पर बायोफिल्म को ठीक करता है, वह कम लॉग रिडक्शन 11 प्रतीत होगा। इस प्रकार के परिदृश्य से प्रयोगात्मक डेटा की पक्षपातपूर्ण व्याख्या हो सकती है।
प्रकाशन की तैयारी में, साहित्य की समीक्षा ने निर्धारित किया कि कटाई और अलग-अलग बायोफिल्म के लिए सामान्य दृष्टिकोणों में स्क्रैपिंग, स्वैबिंग, sonication, भंवर या इनमें से एक संयोजन शामिल है। स्क्रैपिंग को एक बाँझ छड़ी, स्पैटुला या अन्य उपकरण के साथ सतहों से बायोफिल्म के भौतिक निष्कासन के रूप में परिभाषित किया गया है। स्वैबिंग एक कपास इत्तलादार छड़ी या अन्य निश्चित अवशोषक सामग्री के साथ सतहों से बायोफिल्म को हटाने को संदर्भित करता है। Sonication पानी के माध्यम से वितरित अल्ट्रासोनिक तरंगों के माध्यम से सतहों से बायोफिल्म के विघटन को संदर्भित करता है। भंवर एक ट्यूब के अंदर नमूने के तरल भंवर को प्राप्त करने के लिए एक मिक्सर के उपयोग को संदर्भित करता है। Homogenization एक एकल सेल निलंबन में काटा biofilm clumps कतरनी करने के लिए घूर्णन ब्लेड का उपयोग करता है। इस पेपर में, हम दो अलग-अलग सतह प्रकारों, हार्ड / गैर-झरझरा और झरझरा के लिए तीन कटाई और भेदभाव विधियों को प्रस्तुत करते हैं।
अनुशंसित न्यूनतम जानकारी की एक सूची जो शोधकर्ताओं को प्रकाशनों के तरीकों के अनुभागों में शामिल करनी चाहिए, प्रदान की जाती है। हम आशा करते हैं कि इस जानकारी को शामिल करने से अन्य शोधकर्ताओं को अपने काम को पुन: पेश करने में सक्षम बनाता है। कोई सही कटाई और भेदभाव विधि नहीं है, इसलिए, तकनीक की जांच करने के तरीके के लिए सिफारिशें भी प्रदान की जाती हैं।
आम विकास सतहों से बायोफिल्म को काटने और अलग करने के लिए तीन सामान्य तरीकों को इस लेख में प्रदर्शित किया गया है। यह जानकारी शोधकर्ताओं को बायोफिल्म परीक्षण विधि की समग्र सटीकता और पूर्वाग्रह को बेहतर ढंग से समझने में सक्षम बनाएगी। वर्णित तरीके इस प्रकार हैं: (1) सीडीसी बायोफिल्म रिएक्टर में उच्च तरल पदार्थ कतरनी के तहत पॉली कार्बोनेट कूपन (हार्ड गैर-झरझरा सतह) पर उगाए गए एक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा बायोफिल्म को काटा जाता है और बायोफिल्म फसल और विघटन प्राप्त करने के लिए भंवर और sonication के पांच चरण संयोजन के बाद अलग किया जाता है (2) ए पी एरुगिनोसा कम तरल कतरनी के तहत ड्रिप प्रवाह रिएक्टर में बोरोसिलिकेट ग्लास कूपन (हार्ड गैर-झरझरा सतह) पर उगाई गई बायोफिल्म को काटा जाता है और स्क्रैपिंग और होमोजेनाइजेशन (3) सिलिकॉन ट्यूबिंग (झरझरा सतह) में उगाए गए एक एस्चेरिचिया कोलाई बायोफिल्म को काटा जाता है और स्क्रैपिंग का उपयोग करके अलग किया जाता है, इसके बाद sonication और vortexing होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कटाई और विभेदन विधियों के लिए न्यूनतम जानकारी
वैज्ञानिक समुदाय में पुनरुत्पादक बायोफिल्म डेटा बनाने के लिए, यह आवश्यक है कि लेखकों को बायोफिल्म विधि के विकास, उपचार, नमूनाकरण और विश्लेषण चरणो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पेपर में उनके योगदान के लिए डैनियल ऑर गोविया, ब्लेन फ्रिट्ज, जेनिफर समर्स और फेई सैन ली को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
