Сбор и дезагрегирование: упущенный шаг в исследовании методов биопленки
Summary
В настоящем документе подробно описываются методы, демонстрирующие три распространенных метода сбора и дезагрегирования биопленки на двух типах поверхностей, испытания на прочность метода сбора урожая и минимальную информацию, которую следует учитывать при выборе и оптимизации методов сбора и дезагрегирования для повышения воспроизводимости.
Abstract
Методы биопленки состоят из четырех различных этапов: выращивание биопленки в соответствующей модели, обработка зрелой биопленки, сбор биопленки с поверхности и дезагрегирование сгустков, а также анализ образца. Из четырех этапов сбор урожая и дезагрегирование являются наименее изученными, но, тем не менее, критическими при рассмотрении возможности систематической проверки. В этой статье демонстрируются широко используемые методы сбора и дезагрегирования биопленки, выращенной на трех разных поверхностях. Три метода сбора и дезагрегирования биопленки, почерпнутые из обширного обзора литературы, включают вихри и обработку ультразвуком, скребок и гомогенизацию, а также соскоб, вихрь и обработку ультразвуком. Рассматриваются два типа поверхностей: твердые непористые (поликарбонатное и боросиликатное стекло) и пористые (силиконовое). Кроме того, мы предоставляем рекомендации по минимальной информации, которая должна быть включена при сообщении о применяемой технике сбора урожая, и сопутствующем методе проверки на предвзятость.
Introduction
Определение биопленки эволюционировало за последние несколько десятилетий и охватывает микробную ассоциацию с различными биологическими и/или небиологическими поверхностями, включая неклеточные компоненты1, которые демонстрируют различный рост и генетическую экспрессию2 в матрице. Биопленка обеспечивает защиту от экологических стрессов, таких как сушка, и может сделать действие химических дезинфицирующих средств менее эффективным, что приводит к выживанию микробов. Выжившие в биопленке потенциально могут стать источником патогенных микроорганизмов, которые являются проблемой общественного здравоохранения3.
Методы биопленки состоят из четырех этапов: рост, обработка, отбор проб (сбор и дезагрегирование) и анализ. Рост, первый шаг, где пользователь определяет условия роста организма, температуру, среды и т.д., является наиболее рассмотренным и описанным в литературе по биопленке4,5,6,7. На этапе обработки оценивают противомикробные препараты (например, дезинфицирующие средства) для определения их эффективности либо против зрелой биопленки3,8,9, либо противомикробное средство может быть включено в поверхность для определения способности продукта предотвращать или уменьшать рост биопленки10. Третий этап, отбор проб, включает этапы сбора биопленки с поверхности, на которой она росла, и дезагрегирования удаленных комков3,8,11. Четвертый этап, анализ, может включать в себя количество жизнеспособных клеток, микроскопию, измерения флуоресценции, молекулярные результаты и/или оценку компонента матрицы8,9. Оценка данных дает информацию о результатах эксперимента. Из четырех отбор проб часто является наиболее упускаемым из виду шагом, поскольку он предполагает, что выбранный метод сбора и/или дезагрегирования биопленки эффективен на 100%, часто без проверки11.
Планктонные суспензии бактерий, часто считающиеся однородными, требуют простого вихря перед анализом. Биопленки, однако, представляют собой сложные сообщества, состоящие из микроорганизмов (прокариотических и/или эукариотических), экзополисахаридов, белков, липидов, внеклеточной ДНК и клеток-хозяев12. Необходимы шаги, выходящие за рамки традиционных планктонных микробиологических методов культивирования, чтобы адекватно собирать биопленку с поверхности, а затем дезагрегировать ее в однородную одноклеточную суспензию. Обширный обзор литературы (информация, не включенная в эту публикацию) показал, что выбор метода удаления и дезагрегирования зависит от ряда факторов, включая виды, присутствующие в биопленке, поверхность, к которой прикреплена биопленка (непористая или пористая), доступность к поверхностям роста (легко снимаемый купон или физическое разрушение аппарата, в котором растет биопленка), геометрия поверхности (площадь и форма), плотность биопленки на поверхностях роста и имеющееся лабораторное оборудование.
Когда биопленка собирается с поверхности, полученная клеточная суспензия является гетерогенной. Для того чтобы эта неравномерная подвеска была точно перечислена, она должна быть дезагрегирована на отдельные ячейки. Количество жизнеспособных пластин предполагает, что колониеобразующая единица происходит от одной бактерии. Если на питательную среду поместить агрегаты биопленки, невозможно различить отдельные клетки, что может привести к неточным оценкам. Например, во время тестирования эффективности дезинфицирующих средств, если обработка очень эффективно удаляет биопленку с поверхности по сравнению с контролем, уменьшение бревна может показаться искусственно большим по сравнению с контролем. С другой стороны, химическое дезинфицирующее средство, которое фиксирует биопленку на поверхности по сравнению с контролем, будет иметь более низкое сокращение log11. Такой сценарий может привести к предвзятой интерпретации экспериментальных данных.
В ходе подготовки к публикации обзор литературы определил, что общие подходы к сбору и дезагрегированию биопленки включают соскоб, мазок, обработку ультразвуком, вихрь или их комбинацию. Соскоб определяется как физическое удаление биопленки с поверхностей стерильной палочкой, шпателем или другим инструментом. Тампонирование относится к удалению биопленки с поверхностей с помощью палочки с хлопковым наконечником или другого неподвижного абсорбирующего материала. Обработка ультразвуком относится к разрушению биопленки с поверхностей с помощью ультразвуковых волн, распространяемых через воду. Вихрь относится к использованию смесителя для достижения жидкого вихря образца внутри трубки. Гомогенизация использует вращающиеся лопасти для сдвига собранных сгустков биопленки в одну клеточную суспензию. В этой статье мы представляем три метода сбора и дезагрегирования для двух различных типов поверхностей: твердых/непористых и пористых.
Приведен перечень рекомендуемой минимальной информации, которую исследователи должны включать в разделы методов публикаций. Мы надеемся, что включение этой информации позволит другим исследователям воспроизвести свою работу. Идеального метода сбора и дезагрегирования не существует, поэтому также даются рекомендации по проверке техники.
В этой статье демонстрируются три распространенных метода сбора и дезагрегирования биопленки из общих поверхностей роста. Эта информация позволит исследователям лучше понять общую точность и предвзятость метода тестирования биопленки. Описаны следующие способы: (1) Биопленка Pseudomonas aeruginosa , выращенная на поликарбонатных купонах (твердая непористая поверхность) под высоким сдвигом жидкости в реакторе биопленки CDC, собирается и дезагрегируется после пятиступенчатой комбинации вихрей и обработки ультразвуком для достижения сбора и дезагрегирования биопленки (2) A P. aeruginosa биопленка, выращенная на купонах боросиликатного стекла (твердая непористая поверхность) в реакторе капельного потока при низком сдвиге жидкости, собирается и дезагрегируется с использованием соскоба и гомогенизации (3) Биопленка Escherichia coli , выращенная в силиконовых трубках (пористая поверхность), собирается и дезагрегируется с использованием соскоба, с последующим ультразвуком и вихрем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Минимальная информация для методов сбора урожая и дезагрегирования
Для создания воспроизводимых данных биопленки в научном сообществе крайне важно, чтобы авторы включили как можно больше деталей относительно каждого из этапов роста, обработки, отбора проб и анализа метода…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить признательность Даниэль Орр Говейя, Блейну Фрицу, Дженнифер Саммерс и Фэй Сан Ли за их вклад в подготовку настоящего документа.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
