Skörd och disagregering: Ett förbisett steg i biofilmsmetoder Forskning
Summary
Detta dokument beskriver metoder som visar tre vanliga biofilm skörd och uppdelning tekniker på två yttyper, robusthet testning av en skördemetod och minsta information att tänka på när du väljer och optimerar skörde- och uppdelningstekniker för att öka reproducerbarheten.
Abstract
Biofilmsmetoder består av fyra distinkta steg: att odla biofilmen i en relevant modell, behandla den mogna biofilmen, skörda biofilmen från ytan och dela upp klumpar och analysera provet. Av de fyra stegen är skörden och uppdelningen de minst studerade men ändå kritiska när man överväger potentialen för testbias. Denna artikel visar vanliga skörde- och disagregeringstekniker för biofilm som odlas på tre olika ytor. De tre biofilm skörd och disaggregering tekniker, hämtat från en omfattande litteratur översyn, inkluderar virvel och ultraljudsbehandling, skrapning och homogenisering och skrapning, virvel och ultraljudsbehandling. Två yttyper beaktas: hårt icke-poröst (polykarbonat och borosilikatglas) och poröst (silikon). Dessutom ger vi rekommendationer för den minsta information som bör inkluderas vid rapportering av den skördande teknik som följts och en medföljande metod för att kontrollera om det finns partiskhet.
Introduction
Definitionen av biofilm har utvecklats under de senaste decennierna och omfattar mikrobiell associering med en mängd olika biologiska och/eller icke-biologiska ytor, införande av icke-cellulära komponenter1 som uppvisar olika tillväxt och genetiskt uttryck2 i en matris. Biofilm ger skydd mot miljöbelastningar som torkning och kan göra verkan av kemiska desinfektionsmedel mindre effektiv vilket resulterar i mikrobers överlevnad. De överlevande i en biofilm kan potentiellt utgöra en källa till patogena mikroorganismer som är ett folkhälsoproblem3.
Biofilmsmetoder består av fyra steg, tillväxt, behandling, provtagning (skörd och uppdelning) och analys. Tillväxt, det första steget, där användaren bestämmer organismens tillväxtförhållanden, temperatur, media etc., är det mest ansedda och rapporterade i biofilmslitteraturen4,5,6,7. Behandlingssteget utvärderar antimikrobiella medel (t.ex. desinfektionsmedel) för att bestämma deras effekt antingen mot en mogen biofilm3,8,9 eller det antimikrobiella läkemedlet kan införlivas i ytan för att bestämma produktens förmåga att förhindra eller minska biofilmstillväxt10. Det tredje steget, provtagning, inkluderar steg för att skörda biofilmen från den yta där den växte och för att disaggregera de borttagna klumparna3,8,11. Det fjärde steget, analys, kan omfatta livskraftiga cellantal, mikroskopi, fluorescensmätningar, molekylära resultat och/eller en matriskomponentbedömning8,9. Bedömning av data ger information om resultatet av ett experiment. Av de fyra är provtagning ofta det mest förbisedda steget eftersom det förutsätter att den valda biofilmskördnings- och/eller uppdelningstekniken är 100% effektiv, ofta utan verifiering11.
Planktoniska suspensioner av bakterier, som ofta anses vara homogena, kräver enkel virvel före analys. Biofilmer är dock komplexa samhällen som består av mikroorganismer (prokaryota och/eller eukaryota), exopolysackarider, proteiner, lipider, extracellulärt DNA och värdceller12. Steg bortom traditionella planktoniska mikrobiologiska odlingsmetoder behövs för att på ett adekvat sätt skörda biofilm från en yta och sedan dela upp den i en homogen encellig suspension. En omfattande litteraturöversikt (information som inte ingår i denna publikation) visade att valet av borttagnings- och uppdelningsteknik är beroende av ett antal faktorer, inklusive arter som finns i biofilmen, yta som biofilmen är fäst vid (icke-porös eller porös), tillgänglighet till tillväxtytor (lätt avtagbar kupong eller fysisk destruktion av apparater där biofilmen växer). ytgeometri (yta och form), biofilms densitet på tillväxtytor och tillgänglig laboratorieutrustning.
När biofilm skördas från en yta är den resulterande cellupphängningen heterogen. Om denna nonuniform suspension ska räknas upp korrekt måste den delas upp i enskilda celler. Livskraftiga platträkningar förutsätter att en kolonibildande enhet härstammar från en bakterie. Om aggregat av biofilm placeras på tillväxtmediet är det omöjligt att skilja enskilda celler som kan leda till felaktiga uppskattningar. Till exempel, under desinfektionseffekttestning, om en behandling tar bort biofilm mycket effektivt från en yta jämfört med kontrollen, kan stockreduktionen verka artificiellt stor jämfört med kontrollen. Å andra sidan verkar ett kemiskt desinfektionsmedel som fixerar biofilm på en yta jämfört med kontrollen ha en lägre stockreduktion11. Denna typ av scenario kan leda till partisk tolkning av experimentella data.
Som förberedelse för publiceringen bestämde en genomgång av litteraturen att gemensamma metoder för skörd och disaggregering biofilm inkluderar skrapning, svabba, ultraljudsbehandling, virvel eller en kombination av dessa. Skrapning definieras som fysisk borttagning av biofilm från ytor med en steril pinne, spatel eller annat verktyg. Med svabbning avses avlägsnande av biofilm från ytor med en bomullsspetsad pinne eller annat fast absorberande material. Ultraljudsbehandling avser störningar av biofilm från ytor via ultraljud vågor distribueras genom vatten. Med virvel avser användning av en mixer för att uppnå en flytande virvel av provet inuti ett rör. Homogenisering använder roterande blad för att skjuva skördade biofilmklumpar i en enda cellfjädring. I detta dokument presenterar vi tre skörde- och disagregeringsmetoder för två olika yttyper, hårda/icke-porösa och porösa.
En förteckning över rekommenderad minimiinformation som forskare bör inkludera i metoderna finns avsnitt i publikationer. Vi hoppas att införandet av denna information gör det möjligt för andra forskare att reproducera sitt arbete. Det finns ingen perfekt skörde- och uppdelningsmetod, därför ges också rekommendationer för hur man kontrollerar tekniken.
Tre vanliga metoder för att skörda och disaggregera biofilm från vanliga tillväxtytor demonstreras i den här artikeln. Denna information kommer att göra det möjligt för forskare att bättre förstå den övergripande precisionen och förspänningen hos en biofilmtestmetod. De metoder som beskrivs är följande: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm odlad på polykarbonatkuponger (hård icke-porös yta) under hög vätskeskjuvning i CDC Biofilm Reactor skördas och disaggregeras efter en femstegskombination av virvel och ultraljudsbehandling för att uppnå biofilm skörd och disaggregering (2) A P. aeruginosa Biofilm som odlas på borosilikatglaskuponger (hård icke-porös yta) i droppflödesreaktorn under låg vätskeskjuvning skördas och disaggreras med skrapning och homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm odlad i silikonrör (porös yta) skördas och disaggreras med skrapning, följt av ultraljudsbehandling och virvel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minsta information för avverknings- och disagregeringsmetoder
För att skapa reproducerbara biofilmsdata i hela forskarsamhället är det absolut nödvändigt att författarna innehåller så mycket detaljer som möjligt om vart och ett av tillväxt-, behandlings-, provtagnings- och analysstegen i en biofilmmetod. Standardiseringen av biofilmsmetoder har hjälpt till i denna strävan eftersom det gör det möjligt för forskaren att hänvisa till en specifik metod och eventuella relevanta ändringar….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill uppmärksamma Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers och Fei San Lee för deras bidrag till denna tidning.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Riferimenti
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
