Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.
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Articolo metodologico
Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vasi sanguigni sono distribuiti ubiquitariamente all'interno di tutti i tessuti del corpo e svolgono diverse funzioni. Pertanto, la derivazione di cellule endoteliali vascolari mature, che rivestono i lumi dei vasi sanguigni, da cellule staminali pluripotenti umane è cruciale per una moltitudine di applicazioni di ingegneria e rigenerazione tissutale. In vivo, le cellule endoteliali primordiali derivano dalla linea mesodermica e sono specificate verso sottotipi specifici, tra cui arterioso, venoso, capillare, emogenico e linfatico. Le cellule endoteliali emogeniche sono di particolare interesse perché, durante lo sviluppo, danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, che generano quindi tutte le linee di sangue per tutta la vita. Pertanto, la creazione di un sistema per generare cellule endoteliali emogeniche in vitro offrirebbe l'opportunità di studiare la transizione endoteliale-ematopoietica e potrebbe portare alla produzione ex vivo di prodotti sanguigni umani e a una ridotta dipendenza da donatori umani. Mentre esistono diversi protocolli per la derivazione di cellule endoteliali progenitrici e primordiali, non è stata descritta la generazione di cellule endoteliali emogeniche ben caratterizzate da cellule staminali umane. Qui viene presentato un metodo per la derivazione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana: un protocollo di differenziazione con cellule striate primitive formate in risposta all'inibitore GSK3β (CHIR99021), quindi induzione della linea mesodermica mediata da bFGF, seguita dallo sviluppo di cellule endoteliali primordiali promosso da BMP4 e VEGF-A, e infine specificazione di cellule endoteliali emogeniche indotte dall'acido retinoico. Questo protocollo produce una popolazione ben definita di cellule endoteliali emogeniche che possono essere utilizzate per comprendere ulteriormente la loro regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica, che ha il potenziale per essere applicata alle applicazioni terapeutiche a valle.
Introduzione
Le cellule endoteliali (ECs) sono una popolazione eterogenea di cellule che svolgono molteplici funzioni in tutto il corpo umano e nei tessuti ingegnerizzati. Oltre a sostenere e regolare altri tipi di cellule (ad esempio, cardiomiociti1, cellule osteoblastiche2), queste funzioni includono la formazione di una barriera selettiva tra sangue e tessuti e l'assistenza nella formazione dei tessuti3. La differenziazione delle EC mature durante lo sviluppo normale richiede diverse vie di segnalazione. Le EC primordiali derivano dai progenitori del mesoderma e sono quindi specificate verso fenotipi arteri....
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Protocollo
1. Reagenti e preparazione dei reagenti
NOTA: un elenco dei reagenti è fornito nella tabella dei materiali.
- Ottenere le linee di cellule staminali pluripotenti umane: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
NOTA: La generazione di EC emogeniche può essere più efficiente nella linea cellulare H1. - Preparare le scorte di proteine della matrice: Aliquotare la proteina della matrice in provette pre-refrigerate da 1,5 mL (su ghiaccio) in modo che ogni provetta contenga 1 mg di proteine della matrice. 1 mg di proteina della matrice è sufficiente per rivestire tutti i pozzetti di due piastre da 6 pozzetti (12 pozzetti in tot....
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Risultati
Uno schema che delinea le specifiche delle EC primordiali e delle EC emogeniche dalle hESC e un'immagine rappresentativa delle cellule 24 ore dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 1. Seguendo le specifiche, le EC primordiali e le EC emogeniche sono FACS purificate rispettivamente nei giorni 5 e 8. Le EC primordiali sono definite come CD31+ CD45- e le EC emogeniche sono definite come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-.......
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Discussione
Qui, vengono delineati i passaggi per la produzione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana utilizzando un sistema di coltura 2D senza siero e alimentatore murino (Figura 1). Questo protocollo espande un metodo descritto da Sriram et al. (2015) per ottenere EC primordiali38. La natura primordiale e il potenziale di specificazione delle EC CD31+ CD45- sono dimostrate coltivando queste cellule su.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalle sovvenzioni NIH HL128064 e U2EB017103. Un ulteriore supporto è stato fornito dalla sovvenzione CT Innovations 15-RMB-YALE-04.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre da 15 cm | Corning | 430599 | trattate con coltura tissutale |
| 35 mm | Corning | 430165 | trattate con coltura tissutale |
| Corning | 3516 | ||
| Reagente antimicrobico Marca: Normocin | Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R& Sistemi D | 233-FB-025 | uso a 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | uso a 25 ng/mL |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Soluzione di distacco cellulare Marca: Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R& D systems | 1506-D4/CF | ricombinante umano; uso a 10 μ g/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali Marca: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) | Tubi Lonza | CC-3162 | |
| FACS | Corning | 352235 | polistirene fondo rotondo con tappo filtrante |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectina | ThermoFisher Scientific | 33016015 | uso a 4 μ g/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; utilizzare a 5 μ M |
| Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Acido cloridrico (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Proteina della matrice Marca: Matrigel | Corning | 356230 | Fattore di crescita ridotto. Fare riferimento al certificato di analisi del lotto per determinare la concentrazione di proteine (Matrigel). Questa concentrazione è necessaria per calcolare il volume di Matrigel che contiene 1 mg di proteine. |
| Terreno a base di metilcellulosa Marca: MethoCult H4435 Enriched | Stemcell Technologies | 4435 | |
| Terreno di differenziazione di cellule staminali pluripotenti Marca: STEMdiff APEL 2 | Stemcell Technologies | 5270 | |
| Cellule staminali pluripotenti: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | umano; H9-FUCCI sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Ludovic Vallier presso il Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Acido retinoico | Sigma Aldrich | R2625-50mg | utilizzare a 0,5 μ M |
| Master mix di trascrizione inversa Marca: iScript Trascrizione inversa Supermix | BioRad | 1708840 Kit di estrazione dell'RNA | |
Marca: RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Terreno di crescita delle cellule staminali Marca: mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Verde master mix Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix | BioRad | 1725121 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25299956 | 0,25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | uso a 50 ng/mL |
| &alfa;-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μ g/mL* |
| α-CD34-Blu Pacifico | BioLegend | 343512 | 2 μ g/mL* |
| &alfa;-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μ g/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μ g/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μ g/mL* |
| α-VE-Caderina-PE | BioLegend | 348506 | 2 μ g/mL* |
| * I coniugati fluorescenti anticorpali devono essere ottimizzati in base al selezionatore di cellule utilizzato. Di seguito sono presentate le concentrazioni finali utilizzate in questo studio. |
Riferimenti
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J.
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Ristampe e permessi
