In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Summary

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

Abstract

L'attaccamento covalente dell'ubiquitina (Ub) ai residui interni di lisina di una proteina substrato, un processo chiamato ubiquitilazione, rappresenta una delle più importanti modificazioni post-traduzionali negli organismi eucariotici. L'ubiquitilazione è mediata da una cascata sequenziale di tre classi enzimatiche tra cui enzimi attivanti l'ubiquitina (enzimi E1), enzimi coniuganti l'ubiquitina (enzimi E2) e ligasi di ubiquitina (enzimi E3) e, a volte, fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina (enzimi E4). Qui vengono forniti protocolli in vitro per saggi di ubiquitilazione, che consentono la valutazione dell'attività dell'ubiquitina ligasi E3, la cooperazione tra coppie E2-E3 e la selezione del substrato. Le coppie E2-E3 cooperanti possono essere sottoposte a screening monitorando la generazione di catene libere di poli-ubiquitina e/o l'auto-ubiquitilazione della ligasi E3. L'ubiquitilazione del substrato è definita dal legame selettivo della ligasi E3 e può essere rilevata mediante western blotting della reazione in vitro. Inoltre, viene descritto un saggio di scarica E2~Ub, che è uno strumento utile per la valutazione diretta della cooperazione funzionale E2-E3. Qui, il trasferimento E3-dipendente dell'ubiquitina è seguito dal corrispondente enzima E2 su amminoacidi liberi di lisina (che imitano l'ubiquitilazione del substrato) o lisine interne della stessa ligasi E3 (auto-ubiquitilazione). In conclusione, vengono forniti tre diversi protocolli in vitro che sono veloci e facili da eseguire per affrontare la funzionalità catalitica della ligasi E3.

Introduction

L'ubiquitilazione è il processo mediante il quale Ub è legato covalentemente a una proteina substrato¹. La modificazione Ub è catalizzata da successive reazioni enzimatiche che coinvolgono l'azione di tre diverse classi enzimatiche,ovvero enzimi Ub-attivanti (E1s), enzimi Ub-coniuganti (E2s), Ub ligasi (E3s), ed eventualmente fattori di allungamento della catena Ub (E4s)^2,3,4,5. Dopo l'attivazione dipendente da adenosina trifosfato (ATP) e magnesio (Mg²⁺) di Ub da parte di E1, la cisteina del sito ....

Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti

NOTA: tamponi e reagenti preparati manualmente in laboratorio sono elencati di seguito. Tutti gli altri tamponi e reagenti utilizzati nei protocolli sono stati acquistati da fonti diverse e utilizzati secondo le istruzioni dei produttori.

1. Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS). A tale scopo, mescolare 1,37 M di cloruro di sodio (NaCl), 27 mM di cloruro di potassio (KCl), 80 mM di disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na₂HPO_4.2H₂O) e 20 mM di potassio-diidrogeno fosfato (KH₂PO₄) in 1 L di H₂O a doppia distill....

Results

Per identificare gli enzimi E2 che cooperano con l'ubiquitina ligasi CHIP, è stato testato un set di candidati E2 in singole reazioni di ubiquitilazione in vitro. Le coppie E2-E3 che hanno collaborato sono state monitorate dalla formazione di prodotti di ubiquitilazione E3-dipendenti, cioèauto-ubiquitilazione della ligasi E3 e formazione di polimeri Ub liberi. I prodotti di ubiquitilazione sono stati analizzati mediante western blotting. L'interpretazione dei dati si basa sul confronto dimensionale dell.......

Discussion

Questo articolo descrive i metodi di ubiquitilazione di base in vitro per l'analisi della funzione della ligasi E3. Quando si eseguono saggi di ubiquitilazione in vitro, si deve considerare che alcuni enzimi E2 possono eseguire l'auto-ubiquitilazione a causa dell'attacco della loro cisteina attiva sui propri residui di lisina che si trovano in prossimità del sito attivo³⁰. Per aggirare questo problema, si raccomanda l'uso di un mutante E2 in cui il rispettivo residuo di lisina vi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amershan Protran 0.1 µ m NC	GE Healthcare	10600000	membrana di nitrocellulosa
Anti-CHIP	Cell Signaling	2080	Anticorpo monoclonale anti-CHIP di coniglio, clone C3B6
Anti-MYC	Roche	OP10	Anticorpo monoclonale di topo anti-MYC, clone 9E10
Anti-ubiquitina	Upstate	05-944	Anticorpo monoclonale di topo anti-Ub, clone P4D1-A11
Apirasi	Sigma	A6535-100UN
ATP (10x)	Enzo	12091903
BSA	Sigma	A6003-10G
EDTA	Roth	8043.2
KCl	Roth	6781.1
K2HPO4	Roth	P749.2
KH2PO4	Roth	3904.1
LDS tampone campione (4x)	novex	B0007
L-lisina	Sigma	L5501-5G
MES	Roth	4256.4
MeOH	VWR Prodotti chimici	2,08,47,307	100%
Milchpulver	Roth	T145.3
NaCl	Roth	P029.3
NuPAGE Antiossidante	invitrogeno	NP0005
NuPAGE Trasferimento tampone (20x)	novex	NP0006-1
Righello di pagina più	Thermo Fisher	26619	Scala proteica
RotiBlock	Roth	A151.1	Reagente bloccante
SDS (20%)	Roth	1057.1
S1000 Thermal Cycler	Bio Rad	1852196
Trans-Blot Turbo	Bio Rad	1704150EDU	Sistema di trasferimento
Tris base	Roth	4855.3
Tween 20	Roth	9127.2
UbcH Enzyme Set	BostonBiochem	K-980B	E2 enzimi
Ubiquitina	BostonBiochem	U-100H
Enzima attivante l'ubiquitina E1	Enzo	BML-UW941U-0050
Tampone di ubiquitinazione (10x)	Enzo	BML-KW9885-001
Carta assorbente Whatman	Bio Rad	1703969	Carta da filtro extra spessa