L'annotazione digitale con dissezione tissutale automatizzata fornisce un approccio innovativo all'arricchimento del tumore nei casi a basso contenuto tumorale ed è adattabile sia alla paraffina che ai tipi di tessuto congelato. Il flusso di lavoro descritto migliora l'accuratezza, la riproducibilità e la produttività e potrebbe essere applicato sia alla ricerca che alle impostazioni cliniche.
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Articolo metodologico
Protocollo di dissezione automatizzato per l'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale, quelli al di sotto del 20% del contenuto tumorale a seconda del metodo, è necessario per generare dati di qualità riproducibili con molti saggi a valle come il sequenziamento di prossima generazione. La dissezione tissutale automatizzata è una nuova metodologia che automatizza e migliora l'arricchimento tumorale in questi tessuti comuni a basso contenuto tumorale diminuendo l'imprecisione dipendente dall'utente della macro-dissezione tradizionale e le limitazioni di tempo, costi e competenze della microdissezione di acquisizione laser utilizzando la sovrapposizione di annotazioni di immagini digitali su vetrini non macchiati. Qui, le annotazioni digitali di ematossilina ed eosina (H & E) vengono utilizzate per colpire piccole aree tumorali utilizzando una lama di 250 μm2 di diametro in paraffina fissa di formalina non macchiata incorporata (FFPE) o sezioni fresche congelate fino a 20 μm di spessore per l'arricchimento automatico del tumore prima dell'estrazione dell'acido nucleico e del sequenziamento dell'intero esoma (WES). La dissezione automatizzata può raccogliere regioni annotate in tessuti a basso contenuto tumorale da sezioni singole o multiple per l'estrazione di acidi nucleici. Consente inoltre di acquisire ampie metriche di raccolta pre e post-raccolta, migliorando al contempo l'accuratezza, la riproducibilità e l'aumento della produttività con l'utilizzo di un minor numero di diapositive. Il protocollo descritto consente l'annotazione digitale con dissezione automatizzata su FFPE animale e/o umano o tessuti freschi congelati a basso contenuto tumorale e potrebbe anche essere utilizzato per qualsiasi arricchimento della regione di interesse per aumentare l'adeguatezza per le applicazioni di sequenziamento a valle nei flussi di lavoro clinici o di ricerca.
Introduzione
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è sempre più utilizzato sia per la cura del paziente che nella ricerca sul cancro per aiutare a guidare i trattamenti e facilitare la scoperta scientifica. Il tessuto è spesso limitato e piccoli campioni con contenuto tumorale variabile vengono utilizzati di routine. L'adeguatezza e l'integrità del tumore, quindi, rimangono una barriera per ottenere dati significativi. I campioni con percentuali tumorali più basse possono causare difficoltà nel distinguere le varianti reali dagli artefatti di sequenziamento e spesso non sono idonei per NGS1. L'arricchimento tumorale dei casi a basso contenuto tumoral....
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Protocollo
Prima dell'inizio, ottenere campioni di tessuto appropriati secondo i protocolli dell'Institutional Review Board (IRB). Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Genentech, Inc.
1. Preparazione di tessuti e vetrini
- Selezionare FFPE o blocchi di tessuto fresco congelato e utilizzare il metodo di elaborazione corrispondente di seguito.
- Tagliare le sezioni dei blocchi di tessuto su vetrini caricati positivamente allo spessore desiderato. Sezionare in serie il tessuto FFPE in nastri con la prima sezione di riferimento tagliata ad uno spessore appropriato per....
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Risultati
Sono state selezionate sezioni epatiche di topo FFPE e FF contenenti carcinoma colorettale metastatico negli xenotrapianti. Le sezioni sono state colorate H & E (Figura 1A, E, I) e scansionate su un intero imager di diapositive con ingrandimento 20x. Un patologo ha annotato digitalmente le regioni tumorali di interesse e una maschera è stata generata utilizzando un software commerciale e formattata come immagine di riferimento png digitale (Figura 1B.......
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Discussione
Qui viene presentato un protocollo per l'applicazione dell'annotazione digitale e della dissezione automatizzata per sezionare regioni tumorali da FFPE a basso contenuto tumorale o tessuti freschi congelati per l'arricchimento tumorale e l'uso in WES. La combinazione di annotazioni digitali e creazione di maschere con la dissezione automatizzata riduce significativamente il tempo pratico richiesto e le competenze comuni ai metodi classici di arricchimento tumorale, tra cui la macrodissezione manuale e LCM. Il protocollo .......
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Dichiarazioni
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio e Amy A Lo sono dipendenti e azionisti di Genentech e Roche e Mana Javey ed Emmanuel Naouri sono dipendenti e azionisti di Roche.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Carmina Espiritu e Robin E. Taylor per il loro supporto nello sviluppo della dissezione automatizzata e lo staff del Genentech Pathology Core Laboratory che ha supportato questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| riempimento AVENIO Millisect | Roche | 8106533001 | |
| Strumento AVENIO Millisect, Base | Roche | 8106568001 | |
| Strumento AVENIO Millisect, Testa | Roche | 8106550001 | |
| Punte di fresatura AVENIO Millisect Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent G2939BA | ||
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Tampone |
| di incubazione | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Coloratore automatizzato |
| Olio minerale di grado molecolare | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinasi K | Promega | V302B | Tampone di digestione |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus tampone | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus vetrini per microscopio caricati positivamente | Thermo Scientific | 6776214 |
Riferimenti
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al.
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Ristampe e permessi
