15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala
Summary
Hier wird eine detaillierte Beschreibung des im Labor implementierten Protokolls zur Erfassung und Analyse von 15 NRelaxationsdispersionsprofilen mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie bereitgestellt.
Abstract
Die Proteinkonformationsdynamik spielt eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der enzymatischen Katalyse, Ligandenbindung, Allostersion und Signalisierung, die wichtige biologische Prozesse sind. Zu verstehen, wie das Gleichgewicht zwischen Struktur und Dynamik die biologische Funktion steuert, ist eine neue Grenze in der modernen Strukturbiologie und hat mehrere technische und methodische Entwicklungen ausgelöst. Unter diesen liefern CPMG-Relaxationsdispersionslösungs-NMR-Methoden einzigartige, atomar aufgelöste Informationen über die Struktur, Kinetik und Thermodynamik von Proteinkonformationsgleichgewichten, die auf der μs-ms-Zeitskala auftreten. Hier präsentiert die Studie detaillierte Protokolle zur Erfassung und Analyse eines 15 NRelaxationsdispersionsexperiments. Als Beispiel wird die Pipeline zur Analyse der μs-ms-Dynamik in der C-terminalen Domäne des Bakteriums Enzym I gezeigt.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) Relaxation Dispersion (RD) Experimente werden auf einer Routinebasis verwendet, um Konformationsgleichgewichte auf der μs-ms-Zeitskala durch Lösungs-NMR-Spektroskopie1,2,3,4,5zu charakterisieren. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamik sind CPMG-Techniken auf modernen NMR-Spektrometern relativ einfach zu implementieren, erfordern keine speziellen Probenvorbereitungsschritte (z. B. Kristallisation, Probengefrieren oder -ausrichtung und/ oder kovalente Konjugation mit einem fluoreszierenden oder paramagnetischen Tag) und bieten eine umfassende Charakterisierung von Konformationsgleichgewichten, die strukturelle, kinetische und thermodynamische Informationen über Austauschprozesse liefern. Damit ein CPMG-Experiment über ein Konformationsgleichgewicht berichten kann, müssen zwei Bedingungen gelten: (i) Die beobachteten NMR-Spins müssen unterschiedliche chemische Verschiebungen in den Zuständen aufweisen, die einem Konformationsaustausch unterzogen werden (Mikrozustände) und (ii) der Austausch muss auf einer Zeitskala von ~ 50 μs bis ~ 10 ms stattfinden. Unter diesen Bedingungen ist die beobachtete Querrelaxationsrate ( 
) die Summe des intrinsischenR2 (das in Abwesenheit von μs-ms-Dynamik gemesseneR2) 
und des Austauschbeitrags zur Querrelaxation (Rex). Der Rex-Beitrag zuR2-Obs kann schrittweise abgeschreckt werden, indem der Abstand zwischen den 180°-Pulsen, die den CPMG-Block der Pulssequenz ausmachen, verringert wird, und die resultierenden RD-Kurven können mit der Bloch-McConnell-Theorie modelliert werden, um die chemische Verschiebungsdifferenz zwischen Mikrozuständen, die fraktionierte Population jedes Mikrostaates und die Austauschraten zwischen Mikrozuständen zu erhalten (Abbildung 1)1,2,3.
Für 15N-CPMG-Experimente wurden in der Literatur mehrere verschiedene Pulssequenzen und Analyseprotokolle berichtet. Hierin wird das im Labor implementierte Protokoll beschrieben. Insbesondere werden die entscheidenden Schritte zur Vorbereitung der NMR-Probe, zum Aufbau und zur Erfassung der NMR-Experimente sowie zur Verarbeitung und Analyse der NMR-Daten vorgestellt (Abbildung 2). Um die Übertragung des Protokolls auf andere Labore zu erleichtern, werden das Pulsprogramm, Verarbeitungs- und Analyseskripte sowie ein Beispieldatensatz als Supplemental Files zur Verfügung gestellt und stehen unter (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) zum Download zur Verfügung. Die bereitgestellte Pulssequenz beinhaltet einen vierstufigen Phasenzyklus im CPMG-Block zur Unterdrückung von offsetabhängigen Artefakten6 und ist für die Erfassung mehrerer verschachtelter Experimente codiert. Diese verschachtelten Experimente haben eine identische Relaxationsperiode, aber eine unterschiedliche Anzahl von Refokussierpulsen, um verschiedene CPMG-Felder zu erreichen7. Wichtig zu beachten ist auch, dass das beschriebene Pulsprogramm die 15N R2 der TROSY-Komponente des NMR-Signals8 misst. Insgesamt wurde das Protokoll erfolgreich zur Charakterisierung des Konformationsaustausches in mittelgroßen und großformatigen Proteinen4,5,9,10angewendet. Für kleinere Systeme (<20 kDa) empfiehlt sich die Verwendung einer auf Heteronukleärer Single Quantum Coherence (HSQC) basierenden Pulssequenz11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt das im Labor implementierte Protokoll zur Erfassung und Analyse von 15N RD-Daten über Proteine. Insbesondere werden die entscheidenden Schritte zur Vorbereitung der NMR-Probe, zur Messung der NMR-Daten und zur Analyse der RD-Profile behandelt. Im Folgenden werden einige wichtige Aspekte bezüglich der Erfassung und Analyse von RD-Experimenten diskutiert. Für eine eingehendere Beschreibung des Experiments und die Datenanalyse wird jedoch ein sorgfältiges Studium der Originalliter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel von NIGMS R35GM133488 und vom Roy J. Carver Charitable Trust an V.V. unterstützt.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
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