Test rapidi di sensibilità antimicrobica mediante imaging Raman scattering stimolato dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio

Summary

Questo protocollo presenta test rapidi di suscettibilità antimicrobica (AST) entro 2,5 ore mediante imaging Raman scattering stimolato da singole cellule del metabolismo di D₂O. Questo metodo si applica ai batteri nelle urine o nell’ambiente del sangue intero, che è trasformativo per l’AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Abstract

Per rallentare e prevenire la diffusione di infezioni resistenti agli antimicrobici, è urgente determinare quantitativamente gli effetti antimicrobici sugli agenti patogeni. In genere ci vogliono giorni per completare l’AST con metodi convenzionali basati sulla cultura a lungo termine e non funzionano direttamente per i campioni clinici. Qui, riportiamo un rapido metodo AST abilitato dall’imaging di scattering Raman stimolato (SRS) dell’incorporazione metabolica dell’ossido di deuterio (D₂O). L’incorporazione metabolica di D₂O nella biomassa e l’inibizione dell’attività metabolica in seguito all’esposizione agli antibiotici a livello di singolo batterio sono monitorate mediante imaging SRS. La concentrazione di inattivazione del metabolismo a singola cellula (SC-MIC) dei batteri dopo l’esposizione agli antibiotici può essere ottenuta dopo un totale di 2,5 ore di preparazione e rilevamento del campione. Inoltre, questo rapido metodo AST è direttamente applicabile a campioni batterici in ambienti biologici complessi, come l’urina o il sangue intero. L’imaging metabolico SRS dell’incorporazione del deuterio è trasformativo per l’AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Introduction

La resistenza antimicrobica (AMR) è una crescente minaccia globale per il trattamento efficace delle malattie infettive¹. Si prevede che la resistenza antimicrobica causerà ulteriori 10 milioni di morti all’anno e una perdita di PIL globale di 100 trilioni di dollari entro il 2050 se non verrà intrapresa alcuna azione per combattere i batteri resistenti agli antibiotici ^1,2. Ciò sottolinea l’urgente necessità di metodi diagnostici rapidi e innovativi per i test di sensibilità agli antibiotici (AST) dei batteri infettivi per rallentare la comparsa di batteri resistenti agli antibiotici e ridurre il relativo tasso di mortalità³. Per garantire il miglior risultato clinico possibile, è fondamentale introdurre una terapia efficace entro 24 ore. Tuttavia, l’attuale metodo gold standard, come la diffusione del disco o il metodo di diluizione del brodo, di solito richiede almeno 24 ore per la procedura di preincubazione per i campioni clinici e ulteriori 16-24 ore per ottenere i risultati della concentrazione inibitoria minima (MIC). Nel complesso, questi metodi richiedono troppo tempo per guidare una decisione immediata per il trattamento delle malattie infettive nella clinica, che porta alla comparsa e alla diffusione della resistenza antimicrobica⁴.

I metodi genotipici AST, come le tecniche basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR)⁵, sono stati sviluppati per una rapida rilevazione. Tali tecniche misurano le sequenze genetiche specifiche di resistenza al fine di fornire risultati rapidi AST. Non si basano su colture cellulari dispendiose in termini di tempo; Tuttavia, vengono testate solo specifiche sequenze genetiche note con resistenza. Pertanto, la sua applicazione è limitata a varie specie batteriche o diversi meccanismi di resistenza. Inoltre, non possono fornire risultati MIC per le decisioni terapeutiche ^6,7. Inoltre, sono in fase di sviluppo nuovi metodi fenotipici per l’AST rapida per superare queste limitazioni⁸, compresi i dispositivi microfluidici 9,10,11,12,13, i dispositivi ottici^14,15,16, l’AST fenotipico che quantifica il numero di copia degli acidi nucleici^17,18 e i metodi spettroscopici Raman ^19, 20,21,22,23,24. Questi metodi riducono il tempo per guidare i risultati AST, tuttavia, la maggior parte di essi sono applicabili solo agli isolati batterici, non direttamente ai campioni clinici, e richiedono ancora una preincubazione a lungo termine.

In questo lavoro, presentiamo un metodo per determinare rapidamente la suscettibilità dei batteri nelle urine e nel sangue intero attraverso il monitoraggio dell’attività metabolica cellulare mediante imaging SRS. L’acqua (H₂O) partecipa alla stragrande maggioranza dei processi essenziali di sintesi biomolecolare nelle cellule viventi. Come isotopologo dell’acqua, attraverso la reazione di scambio H/D catalizzata da enzimi tra l’atomo di idrogeno redox-attivo in NADPH e l’atomo D in D₂O, il deuterio può essere incorporato nella biomassa all’interno di una cellula^25,26. Una reazione di sintesi degli acidi grassi deuterati è mediata dal deuterio marcato NADPH. L’incorporazione di D₂O nelle reazioni degli amminoacidi (AA) provoca la produzione di proteine deuterate²⁶ (Figura 1). In questo modo, le biomolecole contenenti legami C-D appena sintetizzate in singole cellule microbiche possono essere impiegate come marcatore di attività metabolica generale da rilevare. Per leggere i legami C-D sintetizzati de novo, la spettroscopia Raman, uno strumento analitico versatile che fornisce informazioni chimiche specifiche e quantitative delle biomolecole, è ampiamente utilizzata per determinare la suscettibilità antimicrobica e ridurre significativamente il tempo di test a poche ore^27,28,29,30 . Tuttavia, a causa della bassa efficienza intrinseca del processo di scattering Raman, la spettroscopia Raman spontanea è di bassa sensibilità di rivelazione. Pertanto, è difficile ottenere risultati di immagini in tempo reale utilizzando la spettroscopia Raman spontanea. Lo scattering Raman coerente (CRS), incluso lo scattering Raman coerente anti-Stokes (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS), ha raggiunto un’elevata sensibilità di rivelazione a causa del campo luminoso coerente per generare ordini di grandezza più grandi di quello della spettroscopia Raman spontanea, rendendo così l’imaging chimico ad alta velocità, specifico e quantitativo a livello di singola cellula 31,32,33,34,35 ,^36,37,38,39.

Qui, sulla base del nostro lavoro più recente⁴⁰, presentiamo un protocollo per la determinazione rapida dell’attività metabolica e della suscettibilità antimicrobica mediante imaging SRS C-D a femtosecondi dell’incorporazione di D₂O di batteri nel mezzo normale, nelle urine e nell’ambiente del sangue intero a livello di singola cellula. L’imaging SRS a femtosecondi facilita il monitoraggio della concentrazione di inattivazione del metabolismo a singola cellula (SC-MIC) contro gli antibiotici a livello di singolo batterio entro 2,5 ore. I risultati SC-MIC sono convalidati dal test MIC standard tramite microdiluizione del brodo. Il nostro metodo è applicabile per determinare la suscettibilità antimicrobica dei batteri infezione del tratto urinario (UTI) e dell’infezione del flusso sanguigno (BSI) patogeni con un tempo di analisi molto ridotto rispetto al metodo convenzionale, che apre l’opportunità di una rapida AST fenotipica nella clinica a livello di singola cellula.

Protocol

L’uso di campioni di sangue umano è conforme alle linee guida dell’IRB della Boston University e del National Institutes of Health (NIH). Nello specifico, gli esemplari provengono da una banca e sono completamente deidentificati. Questi esemplari non sono considerati soggetti umani dall’ufficio dell’Institutional Review Board (IRB) della Boston University. 1. Preparazione di batteri e antibiotici soluzione madre Preparare la soluzione madre di antibiotici (gentamicina solfato o amox…

Representative Results

L’effetto del tempo di incubazione sull’incorporazione del deuterio è misurato mediante microspettroscopia Raman spontanea nella regione C-D (da 2070 a 2250 cm-1) e C-H (da 2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Gli spettri Raman a singola cellula time-lapse di P. aeruginosa coltivati in terreno contenente il 70% di D 2 O mostrano un aumento dell’intensità CD/CH nel tempo di incubazione da 0 a 180 min. (Figura 4b) La crescente abbondan…

Discussion

L’AST rapida può essere ottenuta valutando la risposta dell’attività metabolica batterica al trattamento antibiotico utilizzando l’imaging metabolico SRS a singola cellula entro 2,5 ore dal campione ai risultati SC-MIC. La risposta dell’attività metabolica batterica e della suscettibilità antimicrobica può essere rilevata monitorando l’incorporazione metabolica di D₂O per la sintesi di biomolecole utilizzando l’imaging SRS dei legami C-D. Poiché l’acqua è utilizzata ovunque nelle cellule viventi, l’imag…

Materials

Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2