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Biologia

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

Abstract

항생제 내성 감염의 확산을 늦추고 예방하기 위해 병원균에 대한 항균 효과를 정량적으로 결정하기 위해 신속한 항균 감수성 검사 (AST)가 시급합니다. 전형적으로 장기간 배양에 기초한 통상적인 방법으로 AST를 완성하는 데 며칠이 걸리며, 이들은 임상 샘플에 대해 직접 작용하지 않는다. 여기에서는 산화중수소(D2O) 대사 혼입의 자극된 라만 산란(SRS) 이미징에 의해 가능해진 신속한 AST 방법을 보고합니다. 바이오매스로의D2O의 대사 혼입 및 단일 박테리아 수준에서 항생제에의 노출에 따른 대사 활성 억제는 SRS 영상화에 의해 모니터링된다. 항생제 노출 시 박테리아의 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)는 총 2.5시간의 샘플 준비 및 검출 후에 얻을 수 있습니다. 또한이 신속한 AST 방법은 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경의 박테리아 샘플에 직접 적용 할 수 있습니다. 중수소 혼입의 SRS 대사 영상화는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST에 대한 변형입니다.

Introduction

항생제 내성(AMR)은감염성 질환의 효과적인 치료에 대한 전 세계적으로 증가하는 위협입니다1. 항생제 내성 박테리아 퇴치를 위한 조치가 취해지지 않으면 AMR로 인해 연간 1,000만 명이 추가로 사망하고 2050년까지 전 세계 GDP 1,00조 달러의 손실이 발생할 것으로 예상됩니다.1,2. 이는 항생제 내성 박테리아의 출현을 늦추고 관련사망률을 줄이기 위해 감염성 박테리아의 항생제 감수성 검사(AST)를 위한 신속하고 혁신적인 진단 방법의 시급한 필요성을 강조합니다3. 최상의 임상 결과를 보장하려면 24시간 이내에 효과적인 치료법을 도입하는 것이 중요합니다. 그러나 디스크 확산 또는 브로스 희석 방법과 같은 현재의 금 표준 방법은 일반적으로 임상 샘플의 사전 배양 절차에 최소 24시간이 필요하고 최소 억제 농도(MIC) 결과를 얻기 위해 추가로 16-24시간이 필요합니다. 전반적으로, 이러한 방법은 클리닉에서 전염병 치료에 대한 즉각적인 결정을 안내하기에는 너무 시간이 많이 걸리며, 이는 항생제 내성의 출현 및 확산으로 이어집니다4.

중합효소연쇄반응(PCR)기반 기술5과 같은 유전형 AST 방법이 신속한 검출을 위해 개발되었습니다. 이러한 기술은 빠른 AST 결과를 제공하기 위해 특정 저항 유전자 서열을 측정합니다. 그들은 시간이 많이 걸리는 세포 배양에 의존하지 않습니다. 그러나 내성이있는 특정 알려진 유전자 서열 만 테스트됩니다. 따라서, 그 적용은 다양한 박테리아 종 또는 다른 저항 메커니즘으로 제한됩니다. 또한 치료 결정 6,7에 대한 MIC 결과를 제공 할 수 없습니다. 게다가, 이러한 한계를 극복하기 위해 신속한 AST를 위한 신규한 표현형 방법이 개발 중이다(8), 미세유체 장치 9,10,11,12,13, 광학 장치14,15,16, 핵산 복제 번호 17,18, 및 라만 분광법(19)을 포함하는 표현형 AST, 20,21,22,23,24. 이러한 방법은 AST 결과를 안내하는 시간을 단축하지만 대부분은 임상 표본에 직접 적용되지 않고 박테리아 분리에만 적용되며 여전히 오랜 시간 사전 배양이 필요합니다.

이 연구에서는 SRS 영상에 의한 세포 대사 활동의 모니터링을 통해 소변 및 전혈에서 박테리아의 감수성을 신속하게 결정하는 방법을 제시합니다. 물 (H2O)은 살아있는 세포에서 필수적인 생체 분자 합성 과정의 대다수에 참여합니다. 물의 동위 원소로서, NADPH의 산화 환원 활성 수소 원자와 D2O의 D 원자 사이의 효소 촉매 H / D 교환 반응을 통해, 중수소는 세포 (25,26) 내부의 바이오 매스로 통합 될 수있다. 중수 소화 지방산 합성 반응은 중수소 표지 NADPH에 의해 매개됩니다. 아미노산 (AA)의 반응에D2O가 혼입되면 중수 소화 단백질 생산 (26)이 발생합니다 (그림 1). 이와 같이, 단일 미생물 세포에서 새롭게 합성된 C-D 결합 함유 생체분자는 검출하고자 하는 일반적인 대사활성 마커로 채용될 수 있다. de novo 합성 C-D 결합을 판독하기 위해 생체 분자의 구체적이고 정량적인 화학 정보를 제공하는 다목적 분석 도구인 Raman 분광법은 항균 감수성을 결정하고 테스트 시간을 몇 시간으로 크게 단축하는 데 널리 사용됩니다.27,28,29,30 . 그러나, 라만 산란 공정의 고유한 낮은 효율로 인해, 자발적 라만 분광법은 검출 감도가 낮다. 따라서 자발적인 라만 분광법을 사용하여 실시간 이미지 결과를 얻는 것은 어려운 일입니다. 코히어런트 안티-스톡스 라만 산란(CARS) 및 자극 라만 산란(SRS)을 포함한 코히어런트 라만 산란(CRS)은 자발적 라만 분광법보다 훨씬 더 큰 크기를 생성하는 코히어런트 라이트 필드로 인해 높은 검출 감도에 도달하여 단일 셀 수준에서 고속, 특이적 및 정량적 화학 이미징을 렌더링합니다. 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

여기에서, 우리의 가장 최근의 연구(40)에 기초하여, 우리는 단일 세포 수준에서 정상 배지, 소변 및 전혈 환경에서 박테리아의D2O혼입의 펨토초 SRS C-D 이미징에 의한 대사 활성 및 항균 감수성의 신속한 결정을 위한 프로토콜을 제시한다. 펨토초 SRS 이미징은 2.5시간 이내에 단일 박테리아 수준에서 항생제에 대한 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. SC-MIC 결과는 브로스 미세 희석을 통한 표준 MIC 테스트에 의해 검증됩니다. 당사의 방법은 기존 방법에 비해 분석 시간이 훨씬 단축된 박테리아 요로 감염(UTI) 및 혈류 감염(BSI) 병원체의 항균 감수성을 측정하는 데 적용할 수 있으며, 이는 단일 세포 수준에서 클리닉에서 빠른 표현형 AST의 기회를 열어줍니다.

Protocol

인간 혈액 표본의 사용은 보스턴 대학의 IRB와 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따릅니다. 특히, 표본은 은행에서 왔으며 완전히 식별되지 않습니다. 이 표본은 보스턴 대학의 기관 검토위원회 (IRB) 사무실에서 인간 대상으로 간주되지 않습니다. 1. 박테리아 및 항생제 원액의 제조 1.5mL 마이크로 튜브의 멸균 1x 인산완충식염수(PBS) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해된 1m…

Representative Results

중수소 혼입에 대한 배양 시간의 영향은 C-D (2070-2250 cm-1) 및 CH (2,800-3,100 cm-1) 영역에서 자발적 라만 미세 분광법으로 측정됩니다 (그림 4a). 70% D2O 함유 배지에서 배양된 녹농균의 타임랩스 단일 세포 라만 스펙트럼은 0분에서 180분까지의 배양 시간에 걸쳐 CD/CH 강도가 증가하는 것을 보여줍니다(그림 4b) 단일 미생물 세포에서 증가?…

Discussion

신속한 AST는 샘플에서 SC-MIC 결과까지 2.5시간 이내에 단일 세포 SRS 대사 영상을 사용하여 항생제 치료에 대한 박테리아 대사 활성의 반응을 평가함으로써 얻을 수 있습니다. 박테리아 대사 활성 및 항미생물 감수성의 반응은 C-D 결합의 SRS 이미징을 사용하여 생체 분자 합성을 위한D2O의 대사 혼입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 물은 살아있는 세포에서 어디에나 사용되기 때문에 SRS ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 NIH R01AI141439에서 J.-X.C 및 M.S로, R35GM136223에서 J.-X.C.로 지원되었습니다.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
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Riferimenti

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Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
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