JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia

Rask antimikrobiell følsomhetstesting ved stimulert Raman-spredningsavbildning av Deuterium-inkorporering i en enkelt bakterie

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Denne protokollen presenterer rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) analyse innen 2,5 timer ved enkeltcellestimulert Raman-spredningsavbildning av D2O-metabolisme. Denne metoden gjelder bakterier i urin- eller fullblodsmiljøet, som er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.

Abstract

For å bremse og forhindre spredning av antimikrobielle resistente infeksjoner, er rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) i akutt behov for å kvantitativt bestemme antimikrobielle effekter på patogener. Det tar vanligvis dager å fullføre AST ved konvensjonelle metoder basert på langtidskulturen, og de fungerer ikke direkte for kliniske prøver. Her rapporterer vi en rask AST-metode aktivert ved stimulert Raman-spredning (SRS) avbildning av deuteriumoksid (D2O) metabolsk inkorporering. Metabolsk inkorporering av D2O i biomasse og metabolsk aktivitetshemming ved eksponering for antibiotika på enkeltbakterienivå overvåkes av SRS-avbildning. Enkeltcellemetabolismens inaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) av bakterier ved eksponering for antibiotika kan oppnås etter totalt 2,5 timer med prøvepreparering og deteksjon. Videre er denne raske AST-metoden direkte anvendelig for bakterieprøver i komplekse biologiske miljøer, som urin eller fullblod. SRS metabolsk avbildning av deuteriuminkorporering er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.

Introduction

Antibiotikaresistens (AMR) er en økende global trussel mot effektiv behandling av smittsomme sykdommer1. Det er spådd at AMR vil forårsake ytterligere 10 millioner dødsfall per år og $ 100 billioner globalt BNP-tap innen 2050 hvis detikke iverksettes tiltak for å bekjempe antibiotikaresistente bakterier 1,2. Dette understreker det presserende behovet for raske og innovative diagnostiske metoder for antibiotikafølsomhetstesting (AST) av smittsomme bakterier for å bremse fremveksten av antibiotikaresistente bakterier og redusere den relaterte dødeligheten3. For å sikre best mulig klinisk resultat er det avgjørende å innføre effektiv behandling innen 24 timer. Imidlertid krever den nåværende gullstandardmetoden, som diskdiffusjon eller buljongfortynningsmetode, vanligvis minst 24 timer for preinkubasjonsprosedyren for kliniske prøver og ytterligere 16-24 timer for å oppnå resultatene av minimal hemmende konsentrasjon (MIC). Samlet sett er disse metodene for tidkrevende til å veilede en umiddelbar beslutning om infeksjonssykdomsbehandling i klinikken, noe som fører til fremvekst og spredning av antimikrobiell resistens4.

Genotypiske AST-metoder, som polymerasekjedereaksjon (PCR)-baserte teknikker5, er utviklet for rask deteksjon. Slike teknikker måler de spesifikke resistensgenetiske sekvensene for å gi raske AST-resultater. De er ikke avhengige av tidkrevende cellekultur; Imidlertid testes bare spesifikke kjente genetiske sekvenser med resistens. Derfor er applikasjonen begrenset til forskjellige bakteriearter eller forskjellige resistensmekanismer. De kan heller ikke gi MIC-resultater for behandlingsbeslutninger 6,7. Dessuten er nye fenotypiske metoder for rask AST under utvikling for å overvinne disse begrensningene8, inkludert mikrofluidiske enheter 9,10,11,12,13, optiske enheter14,15,16, fenotypisk AST som kvantifiserer nukleinsyrekopien nummer17,18 og Raman-spektroskopiske metoder 19, 20,21,22,23,24. Disse metodene reduserer tiden for å veilede AST-resultater, men de fleste av dem gjelder bare for bakterielle isolater, ikke direkte til kliniske prøver, og krever fortsatt langvarig preinkubasjon.

I dette arbeidet presenterer vi en metode for rask bestemmelse av følsomheten til bakterier i urin og fullblod via overvåking av den cellulære metabolske aktiviteten ved SRS-avbildning. Vann (H2O) deltar i de aller fleste essensielle biomolekylære synteseprosesser i levende celler. Som en isotopolog av vann, gjennom enzymkatalysert H / D-utvekslingsreaksjon mellom det redoksaktive hydrogenatomet i NADPH og D-atomet i D2O, kan deuterium inkorporeres i biomasse inne i en celle25,26. En deuterert fettsyresyntesereaksjon er mediert av deuterium merket NADPH. D2O-inkorporering i reaksjoner av aminosyrer (AA) resulterer i deuterert proteinproduksjon26 (figur 1). På denne måten kan de nylig syntetiserte C-D-bindingsholdige biomolekylene i enkeltmikrobielle celler brukes som en generell metabolsk aktivitetsmarkør som skal detekteres. For å lese ut de novo syntetiserte C-D-bindinger, er Raman-spektroskopi, et allsidig analytisk verktøy som gir spesifikk og kvantitativ kjemisk informasjon om biomolekyler, mye brukt til å bestemme antimikrobiell følsomhet og redusere testtiden betydelig til noen få timer27,28,29,30 . På grunn av den iboende lave effektiviteten til Raman-spredningsprosessen har den spontane Raman-spektroskopien imidlertid lav deteksjonsfølsomhet. Derfor er det utfordrende å oppnå bilderesultater i sanntid ved hjelp av spontan Raman-spektroskopi. Koherent Raman-spredning (CRS), inkludert sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimulert Raman-spredning (SRS), har nådd høy deteksjonsfølsomhet på grunn av det sammenhengende lysfeltet for å generere størrelsesordener større enn for spontan Raman-spektroskopi, og derved gjengir høyhastighets, spesifikk og kvantitativ kjemisk avbildning på enkeltcellenivå 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Her, basert på vårt siste arbeid40, presenterer vi en protokoll for rask bestemmelse av metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet ved femtosekund SRS C-D-avbildning av D2O-inkorporering av bakterier i normalt medium, urin og fullblodsmiljø på enkeltcellenivå. Femtosekund SRS-avbildning gjør det mulig å overvåke enkeltcellemetabolismeinaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) mot antibiotika på enkeltbakterienivå innen 2,5 timer. SC-MIC-resultatene valideres ved standard MIC-test via buljongmikrodilusjon. Vår metode er anvendelig for å bestemme antimikrobiell følsomhet for bakterier urinveisinfeksjon (UTI) og blodbaneinfeksjon (BSI) patogener med mye redusert analysetid sammenlignet med konvensjonell metode, noe som åpner muligheten for rask fenotypisk ASAT i klinikken på enkeltcellenivå.

Protocol

Bruken av humane blodprøver er i samsvar med retningslinjene fra IRB ved Boston University og National Institutes of Health (NIH). Spesielt er prøvene fra en bank og er fullstendig deidentifisert. Disse prøvene anses ikke for å være mennesker av institutional review board (IRB) kontor ved Boston University. 1. Fremstilling av bakterier og antibiotika stamløsning Klargjør stamløsningen av antibiotika (gentamicinsulfat eller amoksicillin) i en konsentrasjon på 1 mg/ml oppløst…

Representative Results

Effekten av inkubasjonstid på deuteriuminkorporering måles ved spontan Raman-mikroskopi ved C-D (2070 til 2250 cm-1) og C-H (2 800 til 3 100 cm-1) område (figur 4a). Time-lapse enkeltcellede Raman-spektra av P. aeruginosa dyrket i 70% D 2 O-inneholdende medium viser økende CD / CH-intensitet over inkubasjonstid fra 0 til 180 min. (Figur 4b) Den økende C-D-overfloden i enkeltmikrobielle celler avslører at D2O er inn…

Discussion

Rapid AST kan oppnås ved å vurdere responsen av bakteriell metabolsk aktivitet til antibiotikabehandling ved bruk av enkeltcellet SRS metabolsk avbildning innen 2,5 timer fra prøven til SC-MIC resultater. Responsen av bakteriell metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet kan detekteres ved å overvåke metabolsk inkorporering av D2O for biomolekylsyntese ved bruk av SRS-avbildning av C-D-bindinger. Siden vann er allestedsnærværende brukt i levende celler, gir SRS metabolsk avbildning en universell m…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI141439 til J.-X.C og M.S, og R35GM136223 til J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
check_url/it/62398?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image