الكشف الآلي وتحليل exocytosis
Summary
طورنا برامج رؤية الكمبيوتر الآلي للكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي تتميز مسابير الفلورسنت الحساسة لhH. هنا، ونحن نثبت استخدام واجهة المستخدم الرسومية وRStudio للكشف عن أحداث الانصهار، وتحليل وعرض المعلمات الصدغية من الانصهار، وتصنيف الأحداث إلى وسائط الانصهار متميزة.
Abstract
الوقت TIRF المجهر من GFP الحساسة لhh (pHluorin) تعلق على البروتينات SNARE الحوييل هو وسيلة فعالة لتصور الأحداث وحيدة في زراعة الخلايا. وللاضطلاع بتحديد وتحليل غير متحيزين وفعالين لهذه الأحداث، تم تطوير وتنفيذ نهج قائم على رؤية الحاسوب في MATLAB. يتكون خط أنابيب التحليل من خوارزمية تعريف تقسيم الخلايا والحدث الإكسوسيتيكي. يتضمن نهج الرؤية الحاسوبية أدوات للتحقيق في معلمات متعددة للأحداث الفردية ، بما في ذلك نصف عمر تسوس الفلورسين وذروة ΔF / F ، بالإضافة إلى تحليل كامل للخلايا لتواتر الإفراز. وتستخدم هذه المعلمات وغيرها من معايير الانصهار في نهج التصنيف للتمييز بين وسائط الانصهار متميزة. هنا واجهة المستخدم الرسومية بنيت حديثا ينفذ خط أنابيب التحليل من البداية إلى النهاية. يتم استخدام المزيد من التكيف مع وظيفة ريبلي K في R Studio للتمييز بين الحدوث المجمع أو المشتت أو العشوائي لأحداث الاندماج في كل من المكان والزمان.
Introduction
يبني VAMP-pHluorin أو مستقبلات نقل (TfR) – pHuji البنى هي علامات ممتازة للأحداث exocytic، كما يتم إخماد هذه الفلوروفورس الحساسة ل درجة الحموضة داخل التجويف الحويكل الحمضي والفلوريس مباشرة عند فتح المسام الانصهار بين الحويكل وغشاء البلازما1. بعد فتح المسام الانصهار، تتحلل الفلورية أضعافا مضاعفة، مع بعض التغاير الذي يكشف عن معلومات حول الحدث الانصهار. هنا، يتم وصف تطبيق واجهة مستخدم رسومية (GUI) الذي يقوم تلقائيا بالكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية وتحليلها. يسمح هذا التطبيق للمستخدم بالكشف تلقائيا عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي كشفت عنها علامات حساسة الرقمالحموضة 2 وتوليد ميزات من كل حدث التي يمكن استخدامها لأغراض التصنيف3 (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تحليل تجمع الأحداث exocytic باستخدام دالة K ريبلي.
التصنيف الآلي للأحداث exocytic في وسائط خارجية مختلفة أفيد مؤخرا3. وقد وصفت من قبل وضعين من exocytosis ، الانصهار الكامل الحويكل (FVF) وقبلة وتشغيل الانصهار (KNR) exocytosis4،5،6،7. خلال FVF ، يتوسع مسام الانصهار ، ويتم دمج الحويكل في غشاء البلازما. خلال KNR ، يفتح المسام الانصهار بشكل عابر ثم يعيد ختم4،5،8،9،10. تم تحديد أربعة أنماط من الإصابة بالخلايا العصبية في تطوير، اثنان تتعلق FVF واثنين تتعلق KNR. هذا العمل يدل على أن كلا من FVF و KNR يمكن تقسيمها إلى مزيد من الأحداث الانصهار التي تنتقل على الفور إلى تسوس مضان (FVFi و KNRi) بعد فتح المسام الانصهار أو الأحداث الخارجية التي تظهر تأخير بعد فتح المسام الانصهار قبل أن يبدأ الاضمحلال الفلوري (FVFd وKNRd) (الشكل 1B). يحدد المصنف وضع التقشير لكل حدث اندماجي. هنا تم دمج هذا التحليل في واجهة المستخدم الرسومية التي يمكن تثبيتها في MATLAB في أنظمة التشغيل ويندوز وماك القائمة. يمكن العثور على جميع ملفات التحليل في https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing أو
https://github.com/GuptonLab
Protocol
Representative Results
Discussion
عند استخدام الكشف عن exocytic وتحليل البرمجيات ، يرجى النظر في أن البرنامج يقبل فقط ضغط فقدان .tif الملفات والمدخلات. قد تكون ملفات الصور .tif 8 بت أو 16 بت أو 32 بت الرمادي (قناة واحدة) الصور. يجب تحويل تنسيقات الصور الأخرى إلى أحد هذه الأنواع قبل الإدخال. كمرجع، الأمثلة المستخدمة هنا هي صور تدرج الرم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر داستن ريفيل وريجنالد إدواردز لاختبار رمز واجهة المستخدم الرسومية. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة التي دعمت هذا البحث: بما في ذلك R01NS112326 (SLG) وR35GM135160 (SLG) وF31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Riferimenti
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
