外分泌物的自动检测和分析
Summary
我们开发了自动计算机视觉软件，以检测以pH敏感荧光探头为标志的外细胞事件。在这里，我们演示了使用图形用户界面和 RStudio 来检测聚变事件、分析和显示聚变空间参数，并将事件分类为不同的聚变模式。
Abstract
附着在囊泡SNARE蛋白上的pH敏GFP（普鲁鲁林）的延时TIRF显微镜是可视化细胞培养中单囊外事件的有效方法。为了对此类事件进行公正、高效的识别和分析，MATLAB 开发并实施了基于计算机视觉的方法。分析管道由细胞分割和外阴事件识别算法组成。计算机视觉方法包括用于调查单个事件的多个参数的工具，包括荧光衰变和峰值 +F/F 的半衰期，以及外细胞病频率的全细胞分析。这些和其他聚变参数用于分类方法，以区分不同的聚变模式。在这里，新建的 GUI 从头到尾执行分析管道。进一步适应Ripley在R工作室的K功能用于区分在空间和时间的聚类，分散或随机发生的融合事件。
Introduction
VAMP-普鲁林构造或转移素受体（TfR）-pHuji构造是外延事件的优秀标志，因为这些pH敏感荧光在囊泡和等离子膜1之间的融合孔隙打开后立即在酸囊性流明和荧光中淬火。聚变孔打开后，荧光呈指数级衰变，具有一些异质性，揭示了有关聚变事件的信息。在此处，描述了一个图形用户界面 （GUI） 应用程序，该应用程序可自动检测和分析外显事件。此应用程序允许用户自动检测 pH 敏感标记2 显示的外阴事件，并从可用于分类目的3（ 图1A）的每个事件生成功能。此外，还描述了使用Ripley的K函数分析外阴事件聚类。
最近有报道说，将外阴事件自动分类为不同的外阴模式。两种外分泌模式，全囊融合（FVF）和吻跑融合（KNR）外血症（KNR）以前曾被描述为4，5，6，7。在 FVF 期间，聚变孔扩张，囊泡被整合到等离子体膜中。在KNR期间，融合孔短暂打开，然后重新密封4，5，8，9，10。在发育中的神经元中发现了四种外血病模式，其中两种与FVF有关，两种与KNR有关。这项工作表明，FVF和KNR可以进一步细分为融合事件，在聚变孔打开后立即进入荧光衰变（FVFi和KNRi），或在荧光衰变开始前发生融合孔打开后出现延迟的外阴事件（FVFd和KNRd）（图1B）。分类器识别每个融合事件的外血病模式。在此处，此分析已整合到可安装在基于 Windows 和 Mac 的操作系统中的 MATLAB 中的 GUI 中。所有分析文件都可以在 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 或
https://github.com/GuptonLab
Protocol
Representative Results
Discussion
使用外细胞检测和分析软件时，请考虑程序只接受无损压缩.tif文件作为输入。.tif图像文件可能是 8 位、16 位或 32 位灰度（单通道）图像。在输入之前，必须将其他图像格式转换为其中一种类型。供参考，此处使用的例子是 16 位灰度图像。
在自动检测过程中固有的，将处理减时图像集以进行自动背景减法和光模糊校正。对于背景减法，掩蔽文件的掩蔽区域外的像素在整个图?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢达斯汀·里维尔和雷金纳德·爱德华兹的测试代码和GUI。国家卫生研究院提供了资助，支持了这项研究：包括R01NS1112326（SLG）、R35GM135160（SLG）和F31NS103586（FLU）。
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
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